وصف ملحقات غشاء الخلية ودراسة أدوارهم في ديناميات التصاق خلايا السرطان

الهدف العام هو تحديد تأثير التعديلات التجريبية على ذخيرة تمديد الخلية وكيف ترتبط بوظيفة التصاق الخلية في السرطان. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تحديد الأدوار الرئيسية لذخيرة تمديد غشاء الخلية في تعديل سلوك الخلية مثل التصاق الخلية وحركتها والغزو. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها سهلة الأداء نسبيا ويمكن تكييفها بسهولة مع الظروف التجريبية المختلفة.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاجنا أو تشخيصنا للسرطانات المتقدمة محليا أو النقيلية لأنها تساعد على تحديد التغيرات في ذخيرة امتداد الخلايا المرتبطة بالتغيرات في الخلايا السرطانية في القدرات اللاصقة والغازية. يمكن تطبيقه أيضا على أنظمة أخرى مثل تنظيم القناة الأيونية ، والذي من المعروف أنه يلعب دورا مهما في تكوين تمدد الخلية والعمليات الفسيولوجية الطبيعية. يعد العرض المرئي والتسجيل لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم عد خطوات تمديد الخلية بسبب التفاصيل الدقيقة لمظهرها في بعض الأحيان.

قبل يوم واحد من التصوير ، قم بحساب خلايا SW 13 و SW Neo و SW DKK3 التي نمت في حاضنة 37 درجة مئوية وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون باستخدام مقياس كثافة الدم. ضع أغطية زجاجية معقمة في آبار فردية من ثلاث ألواح بئر ست. استخدم لوحة منفصلة لكل خط خلية وقم بلوحة خطوط الخلايا الثلاثة بكثافة 5 ، 000 خلية لكل بئر في ألواح الآبار الستة هذه.

ضع الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون طوال الليل. في اليوم التالي ، من كل بئر شفق وسط النمو. ثم اغسل الخلايا في مليلتر واحد من PBS الدافئ.

بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من 3.7 في المائة من الفورمالديهايد في كل بئر لإصلاح الخلايا. اترك الخلايا في المثبت لمدة 10 دقائق. بعد الانتهاء من التثبيت ، استنشق الفورمالديهايد.

أضف ملليلتر واحد من البنفسج البلوري بنسبة 0.05 في المائة في كل بئر لتلطيخ الخلايا لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإزالة البقعة الزائدة عن طريق غسل الخلايا بمليلتر واحد من الماء منزوع الأيونات لكل بئر ثلاث مرات. بعد ذلك ، ضع قطرة من كاشف التثبيت الشفاف على شريحة زجاجية مصنفة.

بعد ذلك ، باستخدام ملقط ذو رؤوس دقيقة ، استرجع الغطاء برفق وضعه ووجهه لأسفل فوق الكواشف المتصاعدة. بعد تركيب جميع أغطية الملطخة على الشرائح ، تحت المجهر الضوئي ، اختر 20 عرضا عشوائيا للخلايا غير المتداخلة من كل غطاء. التقط صور مجهرية بتكبير 400 قوة لكل مجال رؤية.

بعد ذلك ، راقب واحسب عدد أنواع الإضافات في كل خلية من الخلايا التمثيلية ال 20. استخدم التعريفات وبروتوكول النص لتوجيه تصنيفك لامتداد الغشاء على أنه خيطي أو فصيصي أو صفيحة. عند حساب أنواع ملحقات الخلايا لأول مرة، قد يكون من المفيد الاحتفاظ بصورة مرجعية متاحة للمراجعة.

إذا كان ذلك ممكنا ، فإن العد بطريقة أعمى فيما يتعلق بعيناتهم التجريبية سيوفر موضوعية إضافية. حدد متوسط عدد الامتدادات من كل نوع لكل خلية في كل من خطوط الخلايا الثلاثة التي تم فحصها. استخدام طريقة واحدة anova لاختبار الفرق في متوسط النسبة المئوية لتمتدادات غشاء الخلية بين أنواع الخلايا المختلفة ذات دلالة إحصائية.

قبل يوم واحد من الفحص ، باستخدام مقياس الدم ، قم بحساب خلايا SW 13 و SW Neo و SW DKK3. قم بتقطيع هذه الخلايا بكثافة 100 ، 000 خلية لكل بئر في ستة ألواح بئر باستخدام صفيحة واحدة لكل نقطة زمنية من النقاط الزمنية الست المحددة التي سيتم اختبارها. ضع الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون طوال الليل.

في اليوم التالي ، أخرج اللوحة من الحاضنة واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS دافئ. ثم أضف 0.5 ملليلتر من محلول تفكك الخلايا غير الأنزيمي أحادي القوة في كل بئر. قم بتدوير الأطباق برفق لتوزيع المحلول المضاف.

احتضن الألواح بالمحلول لأوقات محددة. استنشق اللوحة المخصصة في نهاية كل نقطة زمنية. بعد فترة وجيزة من كل شفط ، اغسل الخلايا بمليلتر واحد من PBS الدافئ.

ثم اضغط برفق على اللوحة لفصل الخلايا المتصلة بشكل غير محكم. كرر الغسيل مع النقر المتقطع مرتين أخريين. أخيرا ، استنشق أي PBS متبقي وقم بإصلاح الخلايا التي بقيت في اللوحة بمليلتر واحد من 3.7 بالمائة من الفورمالديهايد.

بعد الانتهاء من التثبيت ، استنشق الفورمالديهايد. ثم أضف ملليلتر واحد من البنفسج البلوري بنسبة 0.05 في المائة في كل بئر لتلطيخ الخلايا. بمجرد اكتمال التلوين ، قم بإزالة البقعة الزائدة عن طريق غسل الخلايا بملليلتر واحد من الماء منزوع الأيونات لكل بئر ثلاث مرات.

باستخدام مجهر ضوئي بتكبير 100 قوة ، قم بحساب الخلايا المرفقة المتبقية في كل بئر لكل لوحة. ثم حدد النسبة المئوية للخلايا التي ظلت منفصلة خلال النقاط الزمنية المختلفة لخطوط الخلايا الثلاثة التي تم اختبارها. باستخدام anova ثنائي الاتجاه ، يكون اختبار الاختلافات ومعدلات انفصال الخلايا بين خطوط الخلايا الثلاثة ذات دلالة إحصائية.

شكلت خلايا التحكم الملطخة بالبنفسج الكريستالي SW 13 و SW Neo في الغالب filopodia و lamellipodia. في المقابل ، شكلت DKK3 الخلايا التي تعبر عن المزيد من الفصيصات مع الغياب شبه الكامل للصفيحة وعدد قليل جدا من الصخريوط. لاحظ أيضا الاختلافات في القطبية بين DKK3 الخلايا التي تعبر عن وخطوط خلايا التحكم.

يوضح الرسم البياني نسبة امتدادات الخلايا المختلفة في خطوط الخلايا الثلاثة التي تم اختبارها. لاحظ أن النسبة الأعلى بكثير من الفصيصات في DKK3 تعبر عن الخلايا. تظهر الرسوم البيانية الخطية النسبة المئوية للخلايا التي بقيت مرتبطة باللوحة بعد المعالجة بمحلول التفكك للنقاط الزمنية المشار إليها في المحور X.

في جميع النقاط الزمنية حتى 10 دقائق ، أظهرت الخلايا الشفبرة DKK3 قوة ارتباط أعلى بكثير للخلية مقارنة بخلايا التحكم. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في فترة زمنية من يوم إلى يومين اعتمادا على الإعداد التجريبي الخاص بك إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تقييم كيفية تأثير التغييرات في مورفولوجيا امتداد الخلية على قدرة الالتصاق.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد امتدادات الخلايا بدقة فيما يتعلق بالتغيرات في خصائص التصاق الخلايا السرطانية. حظا سعيدا وشكرا على المشاهدة.