الكشف عن الأحماض النووية متعددة في صفيف شعرية البصرية
November 15th, 2017
ويصف هذا البروتوكول تلفيق كاسيت صغير، وجاهزة للاستخدام التي يمكن تطبيقها للكشف البصري للأحماض النووية متعددة في اختبار واحد، التي من السهل أن تعمل. واستخدمت مجموعة شعرية في هذا النهج، للكشف عن الكائنات المعدلة وراثيا أهداف متعددة وذات كفاءة عالية.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تصنيع كاسيت صغير جاهز للاستخدام يمكن تطبيقه للكشف البصري عن الأحماض النووية المتعددة في اختبار واحد سهل التشغيل. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الكشف عن الحمض النووي متعدد الإرسال ، مثل الكائنات المعدلة وراثيا ، أو الكشف عن الكائنات المعدلة وراثيا. لتنظيف الشعيرات الدموية ، ارتد زي المختبر ونظارات واقية وقفازات واقية كيميائية.
ضع الشعيرات الدموية في دورق نظف الشعيرات الدموية ب 30 مل من الأسيتون لمدة خمس دقائق لإزالة المواد العضوية. وبعد ذلك ، اغسل الشعيرات الدموية بالماء منزوع الأيونات.
بعد ذلك ، قم بإعداد محلول سمكة البيرانا عن طريق سكب حوالي عشرة ملليلتر من بيروكسيد الهيدروجين في الدورق ثم أضف 30 مل من حمض الكبريتيك إلى بيروكسيد الهيدروجين مع الاهتزاز البطيء لمنع ارتفاع درجة الحرارة. تأكد من أن المحلول يغطي الشعيرات الدموية بالكامل لمدة 30 دقيقة على الأقل.
ثم اغسل محلول سمكة البيرانا بكمية كبيرة من الماء. اغسل الشعيرات الدموية بالإيثانول والماء منزوع الأيونات لمدة خمس دقائق لكل منهما. جفف الشعيرات الدموية في فرن التجفيف.
بعد ذلك ، قم بوزن قاعدة PDMS وكواشف التروس بنسبة واحد إلى واحد في أنبوب 50 ملليلتر. عادة ، امزج خمسة جرامات من قاعدة المطاط الصناعي مع خمسة جرامات من عامل معالجة المطاط الصناعي. قلب الخليط جيدا لمدة خمس دقائق باستخدام قضيب زجاجي.
ضع الدورق مع PDMS في وعاء جرس مفرغ من الهواء لمدة ثلاثين دقيقة للتفريغ. ثم اسكب PDMS ببطء في أسطوانة قالب الفولاذ المقاوم للصدأ. اترك PDMS يجف لمدة ثلاث ساعات في فرن تجفيف على حرارة 60 درجة مئوية.
بعد معالجة PDMS ، قم بإزالة القالب عن طريق سحب القالب باستخدام الأسطوانة. قم بإزالة PDMS من الأسطوانة عن طريق قطع هامش القالب بمشرط. اغسل PDMS ثلاث مرات بالإيثانول والماء منزوع الأيونات.
ثم جفف دعامة PDMS بالنيتروجين. عالج السطح السفلي لدعم PDMS ليكون كارها للماء عن طريق نقع دعامة PDMS في طبقة فائقة الكارهة للماء لمدة ثانية واحدة. ثم جففه لمدة عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة.
بعد ذلك ، أدخل الشعيرات الدموية التي تم تنظيفها بأربعة ملليمترات في فتحات دعامة PDMS ، مع ترك نقطة صفر خمسة ملليمترات من الشعيرات الدموية خارج السطح العلوي لدعم PDMS. تأكد من أن نهايات الشعيرات الدموية على نفس المستوى. لمعالجة السطح الخارجي للشعيرات الدموية والسطح العلوي لدعم PDMS ليكون كارها للماء ، أضف 15 ميكرولترا من الطبقة الكارهة للماء فوق سطح دعامة PDMS.
تجفيف الهواء مجموعة الشعيرات الدموية المعدلة فائقة المسع. بعد ذلك ، أضف نقطة واحدة ستة ميكرولترات من خليط تثبيت التمهيدي لمجموعة واحدة من البادئات لملء الشعيرات الدموية المقابلة للمجموعة الشعرية وفقا لترتيب مصمم مسبقا. قم بتثبيت المصفوفة في بئر شفاف من صفيحة قياسية مسطحة القاع سعة 96 بئرا وجفف المصفوفة عند 60 درجة مئوية لمدة ساعتين على الأقل.
لتجميع الكاسيت، ضع محول تحميل في الجزء العلوي من المصفوفة المثبتة. تأكد من أن طبق المحول يغطي فقط الأجزاء المكشوفة لجميع الشعيرات الدموية العشرة. لتحضير مزيج تفاعل LAMP ، أضف الكواشف إلى الخليط وفقا لبروتوكول النص وقم بتدوير خليط التفاعل لمدة خمس ثوان بعد إضافة الكالسين.
اقلب الأنبوب برفق عشرين مرة بعد إضافة بوليميراز Bst. يمكن التخلص من تتبع الحمض النووي الموجود في البيئة عن طريق التنظيف مبكرا بمول واحد لكل لتر من حمض الهيدروكلوريك قبل تسليم مزيج LAMP استنشق 20 ميكرولترا من خليط تفاعل LAMP بطرف قياسي 100 ميكرولتر.
أدخل الطرف في مدخل محول التحميل لقفله. حقن خليط التفاعل برفق في طبق المحول. سوف يملأ خليط التفاعل الطبق بسرعة ، ثم يقوم بتحميل الشعيرات الدموية تلقائيا من خلال القوة الشعرية.
قم بإزالة المحول بطرف القفل وأغلق البئر بواسطة فيلم مانع للتسرب شفاف متوافق مع PCR. ثم احتضان المصفوفة الشعرية في حاضنة عند 63 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. للحصول على صور لانبعاث التألق ، استخدم مصباح يدوي للأشعة فوق البنفسجية لإثارة الكالسين المنفصل لإصدار تألق.
التقط صورا من أعلى المصفوفة الشعرية إما بواسطة كاميرا رقمية أو هاتف ذكي. عند التقاط صورة ، تأكد من تكبير الكاميرا على منطقة الشعيرات الدموية قدر الإمكان للحصول على صور عالية الجودة وواضحة. بعد ذلك ، افتح الصورة عن طريق برنامج تحليل الصور.
ثم حدد الصورة ، القالب ، التدرج الرمادي ، نعم والصورة ، القالب ، 16 بت ، نعم. حدد ملف ، حفظ باسم ، تنسيق ، TIFF ، لتحويل الصورة إلى تنسيق TIFF 16 بت. لاستخراج قيمة شدة التألق ، افتح برنامج تحليل المصفوفات الدقيقة.
اسحب صورة تنسيق TIFF 16 بت إلى واجهة البرنامج ، ثم حدد الطول الموجي 532 نانومتر واللون الأخضر لعرض الصورة. بعد ذلك ، قم بإنشاء كتلة جديدة لتحديد موقع إشارة التألق من الشعيرات الدموية. حدد الأدوات والكتل الجديدة ثم ضع عدد الأعمدة والصفوف على أنها واحد إلى واحد واثنين إلى خمسة في واجهات الكتل والميزات بشكل منفصل.
انقر بزر الماوس الأيمن وحدد نموذج الميزات. بعد ذلك ، اضبط الموقع والقطر ليناسب منطقة التألق في الشعيرات الدموية. حدد تحليل لاستخراج قيمة شدة التألق.
أخيرا ، حدد ملف ، واحفظ الإعدادات باسم ، لحفظ مستندات الكتلة. ثم حدد ، قم بحفظ النتائج ، وقم بحفظها لحفظ نتائج شدة التألق. يظهر هنا تخطيط المصفوفة الشعرية.
الشعيرات الدموية من واحد إلى ثمانية ، مسبوقة بمجموعات التمهيدي LAMP تمثل الشعيرات الدموية التسعة والعاشرة اثنين ، لا توجد ضوابط أولية. تظهر هنا صورة الفلورسنت للكشف عن الذرة المعدلة وراثيا ، MON863 ، حيث يمثل اللون الأخضر تضخيم LAMP الإيجابي.
تضخيم ناجح ، يتم تقديمه فقط في الشعيرات الدموية المتوقعة واحد وستة وسبعة وثامن ، دون تلوث بين الشعيرات الدموية الفارغة. هذه الصورة الفلورية مخصصة للكشف عن مزيج الكائنات المعدلة وراثيا. قدم اللون الأخضر تضخيم LAMP الإيجابي.
تمتقديم التضخيم الناجح فقط في الشعيرات الدموية المتوقعة واحد وأربعة وخمسة وستة وسبعة وثمانية دون تلوث بين الشعيرات الدموية الفارغة. الصورة الفلورية الموضحة هنا مخصصة للكشف عن الذرة غير المعدلة وراثيا ، حيث يقدم اللون الأخضر تضخيم LAMP الإيجابي. تم تقديم التضخيم الناجح فقط في الشعيرات الدموية الثمانية المتوقعة ، وبدون تلوث بين الشعيرات الدموية الفارغة.
بمجرد إتقانه ، يمكن إجراء إجراء الكشف هذا في نقطة واحدة وخمس ساعات إذا تم تنفيذه بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيع كاسيت قائم على الشعيرات الدموية لإجراء الكشف عن الحمض النووي المتعدد.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول تصنيع كاسيت صغير جاهز للاستخدام لاكتشاف بصري لعدّة أحماض نووية في اختبار واحد سهل التشغيل. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لاكتشاف الكائنات المعدلة وراثيًا (GMOs) باستخدام مصفوفة الشعرية للكشف المتعدد.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- التكنولوجيا الحيوية
- علم الأحياء الجزيئي
- الهندسة الوراثية
الخلفية
- اكتشاف عدّة أحماض نووية أمر بالغ الأهمية في مجالات مختلفة.
- الكائنات المعدلة وراثيًا (GMOs) تشكل تحديات كبيرة في سلامة الغذاء.
- هناك حاجة لطرق كشف فعّالة لتحليل سريع.
- يمكن لمصفوفات الشعرية تعزيز قدرات الكشف المتعدد.
هدف الدراسة
- لتطوير كاسيت سهل الاستخدام لكشف الأحماض النووية.
- لتحسين كفاءة كشف الكائنات المعدلة وراثيًا.
- لتسهيل البحث في كشف الأحماض النووية المتعددة.
الطرق المستخدمة
- تصنيع كاسيت صغير لكشف الأحماض النووية.
- استخدام مصفوفات الشعرية للكشف المتعدد.
- تنظيف الشعريات باستخدام الأسيتون والماء المنقا.
- طرق كشف بصري لسهولة الاستخدام.
النتائج الرئيسية
- يسمح الكاسيت باكتشاف عدّة أحماض نووية في وقت واحد.
- تعزز مصفوفات الشعرية كفاءة عملية الكشف.
- الطريقة بسيطة وسهلة الاستخدام.
- تطبيقات محتملة في كشف الكائنات المعدلة وراثيًا وغيرها من المجالات.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول نهجًا جديدًا لكشف الأحماض النووية.
- الكاسيت المطور فعال للاختبار المتعدد.
- يمكن للأبحاث المستقبلية توسيع تطبيقاته في التكنولوجيا الحيوية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This platform enables multiplex nucleic acid detection in a single cassette, supporting high-throughput screening needs in GMO testing and microbial monitoring. By combining capillary array technology with LAMP amplification, it reduces assay complexity and resource requirements while maintaining specificity and sensitivity. The visual readout via UV illumination allows rapid, instrument-free results, aligning with decentralized testing demands in biopharma and agricultural biotechnology workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables simultaneous interrogation of multiple genetic targets for hypothesis testing in pathway analysis.
- Operational Value: Reduces reagent consumption and hands-on time through capillary-force-driven sample loading.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides standardized, isolated reaction chambers for reproducible amplification across targets.
- Operational Value: Supports parallel processing of up to eight assays with internal controls for assay validation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates detection of genetically modified elements in complex matrices, supporting GMO safety assessment.
- Operational Value: Enables field-deployable testing with minimal equipment, suitable for process monitoring in biomanufacturing.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows where rapid nucleic acid profiling informs target selection and assay readiness.
- Discovery Biology: Allows parallel testing of gene variants or constructs to clarify functional roles in biological pathways.
- Screening: Generates quantitative fluorescence intensity data for hit confirmation and cross-capillary comparison.
- Analytics: Outputs enable signal threshold setting and contamination assessment via blank capillary controls.
- Translational Research: Supports continuity from target identification to preclinical validation through consistent nucleic acid readouts.
- Enterprise Reuse: Cassette design allows reuse across multiple nucleic acid panels with reconfiguration of primer sets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in multiplex assays by minimizing cross-talk and false positives.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized capillary preparation and isolated reaction volumes.
- Strategic Value: Reduces time-to-result for critical decision points in GMO detection and microbial monitoring.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on simultaneous multi-parameter readouts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface treatment and capillary array assembly for hydrophobic/hydrophilic patterning.
- Depends on access to vacuum degassing and thermal curing equipment for PDMS microfluidic fabrication.
- Necessitates standardization of primer fixation protocols across capillary arrays for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when extending beyond eight targets due to capillary array limitations.
- Relies on user training for consistent UV excitation and image capture to ensure fluorescence quantification accuracy.
