نظم التأسيسي وإيندوسيبلي للتعديل الوراثي في فيفو من خلايا الكبد الماوس باستخدام حقن الوريد ذيل هيدرودينامية

الهدف العام لهذه الطريقة هو التعداء المستقر لخلايا الكبد في الجسم الحي ، مع تركيبات متجهة للجين المحفز أو تعبير shRNA. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أبحاث الكبد. على سبيل المثال ، يمكن تطبيقه للتحقيق في آليات سرطان الكبد والتجديد.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي التعبير المشترك عن CreER جنبا إلى جنب مع تعبير R shRNA المعدل للجينات المحفزة في خلايا الكبد في الجسم الحي الذي يتم تحقيقه عن طريق حقن وريد الذيل الهيدروديناميكي. سيوضح الإجراء إريك هوبنر ، طالب الطب من مختبرنا. ابدأ بدمج 150 نانوغراما من ناقل الدخول الذي يحتوي على الحمض النووي الريبي القصير لدبوس الشعر للبروتين المستهدف مع 150 نانوجرام من ناقل pTC Tet والمخزن المؤقت TE إلى حجم إجمالي يبلغ ثمانية ميكرولترات.

ثم انقل مزيج إنزيم LR clonase II إلى الثلج واحتضانه لمدة دقيقتين. دوامة مرتين أثناء الحضانة. ثم أضف ميكرولترين من مزيج إنزيم LR clonase II إلى التفاعل واحتضانه عند 25 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

بعد الحضانة ، أوقف التفاعل بإضافة ميكرولتر واحد من محلول البروتيناز K. ثم احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة عشر دقائق. بعد ذلك ، قم بتحويل البكتيريا المختصة Stbl3 بميكرولترين من مزيج الاستنساخ باستخدام بروتوكول صدمة حرارية قياسي.

بعد طلاء التحول على ألواح أجار التي تحتوي على أمبيسلين ، احتضن عند 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، اختر مستعمرات مفردة وقم بتلقيح كميات صغيرة من وسط نمو البكتيريا للحضانة بين عشية وضحاها. بعد عزل الحمض النووي وتأكيد سلامة النواقل عن طريق تسلسل سانجر ، قم بإعداد استعدادات الحمض النووي على نطاق أقصى للبنية للحقن.

ابدأ بوزن الفئران. ثم قم بإعداد محلول ملحي معقم يحتوي على 15 ميكروغرام لكل مليلتر من ناقلات الجمال النائم الخالية من السموم الداخلية وميكروغرام واحد لكل مليلتر pchsB5 الخالي من السموم الداخلية. قم بإعداد محلول كاف لحقن كل فأر بحجم 10٪ من وزن جسمه.

املأ حقنة معقمة سعة 3 ملليلتر بالحجم المطلوب لماوس واحد وقم بإرفاق إبرة قياس 27. بعد إضافة كمية مناسبة من المناديل الورقية لترك مساحة صغيرة للحركة ولكن مساحة كافية للتنفس ، أدخل الماوس في مقنع مناسب به فتحات للتنفس. قم بتسخين الذيل باستخدام مصباح الأشعة تحت الحمراء لمدة 30 إلى 60 ثانية مع المراقبة بعناية لعلامات ارتفاع درجة الحرارة مثل الحركة السريعة للذيل أو علامات الإثارة الأخرى.

ثم نظف الذيل بمسحة كحولية. أدخل الإبرة أفقيا تقريبا في أحد وعوري الذيل الجانبية بالقرب من قاعدة الذيل. إذا تم وضعه بنجاح، فقد تتدفق كمية صغيرة من الدم مرة أخرى إلى مخروط الإبرة.

حقن الحجم الكلي في وريد الذيل في غضون ثماني إلى عشر ثوان. بعد الحقن ، قم بإزالة الماوس على الفور من المصفاة. ضغط جرح الحقن بشاش معقم لمدة 30 ثانية على الأقل أو حتى يهدأ أي نزيف.

الحقن الهيدروديناميكي الناجح لوريد الذيل أمرا بالغ الأهمية للتعداء ويعتمد بشكل خاص على سرعة الحقن وحجمه والوقت. لتسهيل الحقن في الوريد ، تأكد من عدم إجهاد الفئران أو الجفاف في يوم الحقن. بعد 30 إلى 60 دقيقة من السكن الفردي في قفص الاسترداد ، انقل الماوس مرة أخرى إلى قفصه الأصلي.

بدء تحريض Cre recombinase بعد 10 إلى 15 يوما من حقن وريد الذيل للسماح بإزالة النواقل غير المتكاملة. قم بإذابة عشرة ملليغرامات من تاموكسيفين في 40 ميكرولتر من الإيثانول واحتضانها عند 55 درجة مئوية لمدة عشر دقائق مع الرج. دوامة عدة مرات حتى يذوب التاموكسيفين.

ثم أضف 960 ميكرولتر من زيت الذرة واحتضنه لمدة خمس دقائق عند 55 درجة مئوية. بعد التبريد ، ارسم المحلول في حقنة أنسولين سعة 1 مليلتر بإبرة قياس 20. ثم قم بالتغيير إلى إبرة قياس 27.

للحقن ، قم أولا بتقطيع الماوس عن طريق الإمساك برقبة الماوس بعناية بالإبهام والإصبع الثاني ، وتثبيت الذيل بين قاعدة اليد والإصبع الرابع والخامس. ثم حقن 0.1 ملليلتر من المحلول داخل الصفاق في الربع السفلي الأيسر من البطن. بالنسبة للتجارب التي تقل عن عشرة أيام ، يتم إعطاء الدوكسيسيكلين باستمرار عن طريق مياه الشرب باستخدام البروتوكول التالي.

أولا ، قم بإذابة خمسة جرامات من السكروز في 100 مل من ماء الصنبور والأوتوكلاف. ثم قم بإذابة 100 ملليغرام من هيكلات الدوكسيسيكلين في خمسة ملليلتر من محلول السكروز في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. بعد ذلك ، استخدم حقنة سعة 10 ملليلتر لتصفية المحلول المعقم من خلال مرشح 0.2 ميكرون.

ثم أضف محلول الدوكسيسيكلين المصفى إلى 95 مل المتبقية من محلول السكروز وقم بتزويد الفأر بالمحلول بدلا من مياه الشرب. تحقق يوميا واستبدلها على الفور إذا أصبح المحلول غائما ، لأن هذا يشير إلى فرط نمو البكتيريا. تحضير حقنة 1 مليلتر بإبرة قياس 27 مع مليلتر واحد من محلول 4٪ paraformaldehyde.

استخدم مقص تشريح وملقط تشريحي لإجراء بضع البطن المتوسط وفضح كبد الفأر القتل الرحيم. حرك الأمعاء الدقيقة إلى اليمين لكشف الوريد البابي والوريد الأجوف السفلي. أدخل إبرة المحقنة المحضرة في الوريد الأجوف السفلي واقطع الوريد البابي.

حقن مليلتر واحد من PFA ببطء لغزارة أنسجة الكبد وإزالة خلايا الدم الحمراء ذاتية الفلورسنت. بعد إزالة الكبد ، اشطفه بالماء وانقله إلى خمسة إلى عشرة ملليلتر من محلول PFA بنسبة 4٪ لإصلاحه بعد التقسيم. أظهر حقن بنية الينقولات التي تجمع بين التعبير التأسيسي لإعادة تركيب Cre المحفز مع التعبير المحفز عن الجين المعدل أو shRNA المفضل في الفئران المراسلة Cre تعبيرا قويا عن جين مراسل GFP بعد تنشيط Cre recombinase بواسطة تاموكسيفين.

بعد علاج الدوكسيسيكلين ، يمكن تصور التعبير الجيني المعدل المحفز عن طريق الأجسام المضادة المناسبة في خلايا الكبد المنقولة. لتعبير shRNA المحفز ، يمكن استخدام تعبير GFP السيتوبلازمي الذي تم اكتشافه عن طريق التلوين المناعي كعلامة بديلة لتعبير shRNA. تم حقن بنية الينقولات التي تحتوي على كاسيت تعبير لوسيفيراز تحت سيطرة بنية محفز خاص بالكبد.

بعد الحقن باللوسيفيرين ، تم تصوير الفئران باستخدام نظام التصوير في الجسم الحي بعد أسبوعين من حقن وريد الذيل الهيدروديناميكي. أظهر التصوير تلألؤ حيوي قوي ومستقر لوسيفيراز في الكبد بعد 15 يوما من الحقن ، مما يدل على أنه يمكن استخدام النظام بنجاح لمتابعة وجود الخلايا المنقولة في الجسم الحي عن طريق التصوير الحيوي. بمجرد إتقان الحقن الهيدروديناميكية في الوريد الذيل يمكن إجراؤها في حوالي 15 دقيقة ، في حين أن الإجراء بأكمله من استنساخ حقن الفئران ، وتحريض تعبير R shRNA المعدل للجين إلى تحضير الكبد سيستغرق حوالي ثلاثة إلى أربعة أسابيع.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم مراعاة حجم البلازميدات وسلامة تسلسلها. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطبيق نظام pTC Tet مع R shRNA المعدل للجين الذي تختاره على أي طراز ماوس Crelux Pbase.