توجه موقع التثبيت من البروتين Morphogenetic 2 العظام للسطوح الصلبة بالكيمياء انقر فوق

الهدف العام لهذه الدراسة هو الإنتاج القوي والقابل للتكرار لسقالة العظم عن طريق الاقتران التساهمي الموجه بالموقع لمتغير BMP2 المصمم حديثا عن طريق كيمياء النقر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في التغلب على المشكلات المرتبطة بالتقنيات الشائعة الاستخدام لعلاج عدم التئام عيوب العظام الطويلة. تتطلب طرق الامتصاص أو التغليف كميات فسيولوجية فائقة من BMP2 التي تثير العديد من الآثار الجانبية الشديدة.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في استخدام كميات أقل من متغير BMP2 المصمم الجديد الذي يتم ربطه تساهميا بالسقالات بطريقة موجهة جانبيا. نشر مستعمرة واحدة بين عشية وضحاها في 50 مل من وسط LB مع 50 ميكروغرام لكل مليلتر من الكاناميسين و 100 ميكروغرام لكل مليلتر من الأمبيسلين عند 37 درجة مئوية. خفف الثقافات بين عشية وضحاها من واحد إلى 20 إلى 800 مل من وسط المرق الرائع المكملة ب 50 ميكروغرام لكل مليلتر من الكاناميسين و 100 ميكروغرام لكل مليلتر من الأمبيسلين.

قم بزراعة المزارع عند 37 درجة مئوية حتى يتم الوصول إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر من 0.7. ثم أضف بروبوفول L-Lycine إلى التركيز النهائي البالغ 10 مللي مولار. تحفيز التعبير الجيني عن طريق إضافة IPTG للتركيز النهائي لمليمولي واحد.

قم بزراعة المزرعة عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة في شاكر مداري بسرعة 180 دورة في الدقيقة. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للثقافة بأكملها عند 9 ، 000 مرة جم لمدة 30 دقيقة. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات البكتيرية في 30 مل من المخزن المؤقت TBSE.

قم بوزن دورق طرد مركزي فارغ وانقل الحبيبات المعاد تعليقها إلى الدورق الفارغ. ثم الطرد المركزي الحبيبات المعاد تعليقها عند 6 ، 360 مرات جم لمدة 20 دقيقة. تخلص من المادة الطافية وقم بوزن الدورق بالحبيبات.

اطرح وزن الدورق الفارغ لحساب وزن الحبيبات. ثم أعد تعليق الحبيبات في المخزن المؤقت STE. استخدم 200 مل من المخزن المؤقت STE لكل 10 جرامات من الحبيبات.

قم بتقطيع التعليق على الجليد قبل الطرد المركزي عند 6 ، 360 مرة جم لمدة 20 دقيقة. تخلص من المادة الطافية وقم بوزن الحبيبات. بعد تكرار خطوات الصوتنة والطرد المركزي أربع مرات ، أعد تعليق الحبيبات في 100 مل من المخزن المؤقت TBS.

جهاز طرد مركزي عند 6 ، 360 مرة جم لمدة 20 دقيقة. ثم تخلص من المادة الطافية وقم بوزن الحبيبات. أعد تعليق الحبيبات في المخزن المؤقت للنوكلياز مع النوكلياز المضاف حديثا باستخدام 10 ملليلتر لكل جرام من الحبيبات.

احتضن التعليق طوال الليل في درجة حرارة الغرفة على لوح التحريك عند 30 دورة في الدقيقة. في اليوم التالي ، أضف Triton Buffer إلى التعليق. يتوافق حجم Triton Buffer للإضافة مع جزء حجم 0.5 من التعليق.

بعد الحضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، قم بالطرد المركزي للتعليق عند 6 ، 360 مرة جم لمدة 20 دقيقة. تخلص من المادة الطافية وقم بوزن الحبيبات. بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات في TE Buffer باستخدام ثمانية ملليلتر لكل جرام من الحبيبات.

بعد الطرد المركزي كما كان من قبل ، تخلص من المادة الطافية وقم بوزن الحبيبات. الآن أعد تعليق الحبيبات بإضافة أربعة ملليلتر لكل جرام من 25 مللي مولار أسيتات الصوديوم ، PH5 ، وخمسة ملليلتر لكل جرام من ستة مولات من كلوريد الجوانيدينيوم مع DTT واحد ملليمول. احتضان التعليق طوال الليل عند أربع درجات مئوية على طبق التحليق.

بعد الطرد المركزي عند 75 ، 500 مرة جم لمدة 20 دقيقة ، يحتوي المطاف على بروتين BMP2 الأحادي غير المطوي. جمع المادة الطافية وتركيز هذا المستخلص إلى كثافة بصرية لكل مليلتر من 20 باستخدام غشاء قطع الوزن الجزيئي بوزن جزيئي بمقدار ثلاثة كيلودالتون في خلية مركزة. أضف المونومرات المركزة في قطرات واحدة إلى مخزن إعادة الطبيعة أثناء التحريك.

ثم احتضان المحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة 120 ساعة في الظلام. اضبط درجة الحموضة للمحلول على 3.0 باستخدام حمض الهيدروكلوريك المركز قبل غسيل المحلول مقابل حمض الهيدروكلوريك المليمولي. قم بتركيز المحلول المغزل باستخدام غشاء قطع بالوزن الجزيئي 10 كيلو دالتون في خلية مركزة.

بعد ذلك ، قم بتحميل محلول البروتين على العمود المتوازن ، وقم بتخفيف الكسور باستخدام تدرج خطي من Buffer B ، وجمع جزأين من المليلتر. قم بتحليل 20 ميكرولترا من كل جزء بواسطة الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد SDS متبوعا بتلطيخ Coomassie Brilliant Blue لتحديد الكسور التي تحتوي على مونومرات والكسور التي تحتوي على ثنائيات. بعد ذلك ، اسحب ثنائي يحتوي على كسور.

الكلى في مجموعة الثنائيات التي تحتوي على كسور بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية مقابل خمسة لترات من حمض الهيدروكلوريك المليمولي. قم بتركيز المنتج باستخدام وحدة مرشح طرد مركزي مركز 10 كيلودالتون قبل تحليل المنتج النهائي بواسطة SDS-PAGE و Coomassie Brilliant Blue Staining. اجمع بين 20 ميكرومولار من نوع BMP2-K3Plk أو BMP2 الذي يستخدم كعنصر تحكم سلبي مع 20 ميكرولترا من حبات الاغاروز المنشطة بالأزيد في عازلة التفاعل بحجم إجمالي يبلغ 500 ميكرولتر.

احتضن لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة على خليط دوار عند 20 دورة في الدقيقة. أوقف التفاعل بإضافة تركيز نهائي يبلغ خمسة مللي مولار EDTA. احتضان المحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة على خلاط دوار بسرعة 20 دورة في الدقيقة.

ثم الطرد المركزي للعينات عند 20 ، 000 مرة جم لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة وجمع المواد الطافية بعد ذلك ، اغسل الحبيبات التي تحتوي على الخرزات ب 1 ، 000 ميكرولتر من HBS 500 Buffer. الطرد المركزي العينة عند 20 ، 000 مرة جم لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة وجمع المادة الطافية.

كرر إجراء الغسيل هذا مرتين أخريين باستخدام HBS 500 Buffer ، وثلاث مرات باستخدام أربعة كلوريد المغنيسيوم المولي ، ومرتين باستخدام PBS ، مع جمع المادة الطافية في كل مرة. قم بتخزين الخرزات المقترنة في 1,000 ميكرولتر من PBS عند أربع درجات مئوية. قم بإجراء مقايسة ALP كما هو موضح في بروتوكول النص.

لإجراء تلطيخ ALP ، قم بزراعة خلايا C2C12 الأرومة المرضية في DMEM مع مصل ربلة الساق الجنينية بنسبة 10٪ بالإضافة إلى 100 وحدة لكل مليلتر من البنسلين G والستربتومايسين عند 37 درجة مئوية في جو مرطب عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون. تغذية خلايا C2C12 بكثافة 30،000 خلية لكل بئر في صفيحة دقيقة 96 بئر. بعد ترك الخلايا تلتصق طوال الليل ، قم بإزالة الوسيط وأضف 20 ميكرولترا لكل بئر من الخرز المقترن PMB2-K3PLK.

ثم أضف 20 ميكرولترا من 0.4٪ من الاغاروز ذات نقطة الانصهار المنخفضة في كل بئر. جهاز الطرد المركزي 96 بئر الصفيحة الدقيقة عند 2 ، 000 مرة غرام لمدة خمس دقائق عند 20 درجة مئوية. ثم أضف 80 ميكرولتر من نفس الوسط.

احتضان عند 37 درجة مئوية في جو مرطب عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 72 ساعة. بعد الحضانة ، قم بإزالة الوسيط مع الحرص على عدم فصل 0.4٪ agarose المتصلب. أضف 100 ميكرولتر لكل بئر من محلول MBT-BCIP شبه مستقيم بخطوة واحدة.

قم بتحليل تلطيخ الفوسفاتيدات القلوي باستخدام الفحص المجهري الضوئي مباشرة بعد ظهور التلوين الأرجواني. استخدم الفحص المجهري للمجال الساطع والتقط الصور. يتم التحقق من صحة النشاط الحيوي لمتغير BMP2-K3Plk المنتج حديثا عن طريق تحريض التعبير الجيني للفوسفاتيز القلوي في خلايا C2C12.

يظهر الاختبار المختبري مستويات مماثلة للتعبير الجيني عن الفوسفاتيز القلوي الناجم عن أي من النوع BMP2 أو BMP2-K3Plk. أسفرت الخرزات المطلية ب BMP2-K3Plk عن طريق إضافة أزيد محفز للألكين الفلورسنت عند تحضينها مع المجال البيئي لمستقبلات BMP 1A غير المسمى. يؤكد ارتباط مستقبلات BMP 1A ب BMP2-K3Plk الاحتفاظ بالنشاط الحيوي بعد الاقتران.

تم إثبات النشاط الحيوي للخرز الوظيفي BMP2-K3Plk من خلال تلطيخ ALP بوساطة ALP. حدث التلوين فقط في تلك الخلايا التي كانت على اتصال مباشر بالخرز الوظيفي BMP2-K3Plk ، مما يؤكد أن البروتين مرتبط بالفعل تساهميا بالخرز وليس امتصاصه فقط. إذا تم إطلاق البروتين في حالة الامتصاص ، ملاحظة تلطيخ أكثر انتشارا على مسافات أكبر ، كما هو موضح هنا بالنسبة لتلوين الفوسفاتيز القلوي عند العلاج ب BMP2-K2Plk القابل للذوبان.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعبير عن البروتينات النشطة بيولوجيا وإنتاجها عن طريق التمدد الجيني وكيفية إقران بروتين خيالي بالكرات المجهرية تساهميا عن طريق تفاعل الكيمياء النقرية. يسمح توليد تباين البروتين عن طريق التوسع الجيني ، من حيث المبدأ ، بإدخال الأحماض الأمينية الاصطناعية في أي موضع من تسلسل البروتين الأساسي. يمكن أن يؤثر إدخال طفرة في تسلسل BMP2 على كفاءة إعادة الطي ويمكن أن يغير أيضا معلمات البروتين.

تطلب إنتاج BMP2-K3Plk تعديلا للطريقة المعمول بها للتعبير عن النوع BMP2. أظهر BMP2-K3Plk المنتج نشاطا بيولوجيا مشابها لنشاط البروتين من النوع while. يمكن تحقيق نهجنا في إقران متغير BMP2 تساهميا بخرز الاغاروز الخيالي عن طريق كيمياء النقر بكفاءة عالية ، مما ينتج عنه حبات خيالية ، واكتشاف التمايز الجيني في المختبر.

يجب ضمان الحماية القياسية وفقا للممارسات المختبرية الجيدة.