في المختبر تحليل سومويليشن لدراسة النشاط ليجاسى E3 السومو

الهدف العام من هذه التجربة هو التحقق من البروتين ذي الأهمية الذي يمكن أن يكون SUMOylated أو هو SUMO E3 lygase. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال SUMOylation ، مثل تحديد SUMO E3 lygase. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن استخدامها للتحقيق في خصوصية SUMO E3 lygase تجاه أشكال SUMO iso المختلفة.

سيوضح الإجراء وان شان يونغ ، طالب دكتوراه من مختبري. لتنقية العلامة K-bZIP ، قم أولا باحتضان 10 ملليلتر من المحللة الخلوية مع 50 ميكرولترا من الخرز المغناطيسي الموسوم بالأجسام المضادة في أنبوب بولي بروبيلين سعة 14 مل. ثم قم بتدوير الأنبوب بمعدل 50 دورة في الدقيقة عند أربع درجات مئوية لمدة ثلاث ساعات في خلاط معلق.

بمجرد التقاط البروتين ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 800 مرة جم لمدة 30 ثانية عند أربع درجات مئوية لحبيبات الخرز. تخلص من كل مليلتر من المادة الطافية باستثناء مليلتر واحد لإعادة تعليق الخرز. وانقل الخرزات المذابة إلى أنبوب سعة 1.5 مل.

لغسل البروتينات الملتقطة ، ضع الأنبوب مع الخرز على حامل مغناطيسي. انتظر حوالي ثلاث ثوان حتى تلتصق الخرزات بالجدران الجانبية للأنبوب ثم قم بإزالة المادة الطافية. لغسل الخرزات ، أضف ملليلترا واحدا من محلول التحلل في أنبوب 1.5 ملليلتر.

ثم اقلب الأنبوب عشر مرات. بعد ذلك ، ضع الأنبوب سعة 1.5 مل على الحامل المغناطيسي وقم بإزالة المادة الطافية بمجرد أن تلتصق الخرزات بالجدران. لغسل الخرزات مرة أخرى ، أضف ملليلترا واحدا من محلول ملحي مخزن بالفوسفات إلى أنبوب 1.5 مليلتر ، واقلبه عشر مرات.

ثم انقل الأنبوب إلى الحامل المغناطيسي ، وقم بإزالة المادة الطافية بمجرد أن تلتصق الخرزات بالجدران الجانبية. لإزالة البروتينات الموسومة K-bZIP من الخرز المغناطيسي الموسوم بالأجسام المضادة ، أضف 100 ميكرولتر عند 150 ميكروغرام لكل مليلتر من ثماني البتيد المخفف في محلول ملحي مخزن بالفوسفات في أنبوب 1.5 ملليلتر. ثم قم بتدوير الأنبوب على خلاط التعليق بسرعة 50 دورة في الدقيقة لمدة عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة.

انقل الأنبوب إلى الحامل المغناطيسي. ثم اجمع K-bZIP الذي يحتوي على مادة طافية. بعد ذلك ، لتحليل علامة K-bZIP المنقاة ، قم بإخضاع واحد إلى خمسة ميكرولترات من البروتين المنقى إلى صفحة SDS ، متبوعا بتلطيخ Coomassie الأزرق.

قم بتحميل 0.5 و 1 و 2 ميكروغرام من ألبومين مصل الأبقار كمعايير على الجل لتحديد تركيز K-bZIP. أثناء معالجة الصورة على الصورة J.Next ، قم بتخفيف K-bZIP المنقى في محلول ملحي مخزن بالفوسفات. للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 100 نانوجرام لكل ميكرولتر.

ويخزن في درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر في كميات صغيرة. أضف ثلاثة ميكرولترات من 100 نانوجرام لكل ميكرولتر من K-bZIP المنقى الموسوم في تفاعل المزيج الرئيسي SUMOylation في المختبر. ثم اخلطي محتويات المزيج الرئيسي برفق واحتضنها عند 30 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات.

بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولترا من صفحة 2X SDS مع مخزن مؤقت للتحميل لإيقاف التفاعل. ثم سخني العينات على حرارة 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق لتشويه طبيعة البروتين. بعد ذلك ، قم بتحميل 20 ميكرولترا من العينة على هلام صفحة SDS بنسبة 10٪.

وقم بتشغيل الجل على حرارة 80 فولت لمدة 120 دقيقة حتى تصل الصبغة إلى قاع الجل. بمجرد انتهاء الشلل الجزئي الكهربائي ، افصل جهاز الجل. وانقل الجل في مخزن مؤقت للنقل شبه الجاف لمدة خمس دقائق.

ثم انقع غشاء PVDF في وعاء آخر مملوء بالميثانول لمدة دقيقة واحدة. قم بإزالة غشاء PVDF من الميثانول وانقعه في مخزن مؤقت للنقل شبه الجاف. ثم حرك الغشاء برفق لمدة خمس دقائق.

قم بإزالة غطاء الأمان للجهاز الكهربائي شبه الجاف. قم بترطيب ورق الترشيح مسبقا. وقم بإعداد شطيرة جل في قاع الأنود البلاتيني.

بعد تثبيت لوحة الكاثود في غطاء الأمان ، قم بتشغيل اللطخة عند تيار ثابت 15 فولت لمدة 90 دقيقة. ثم قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة وإزالة غشاء PVDF بعد فصل الجهاز شبه الجاف. الآن قم بحظر غشاء PVDF بمخزن مؤقت مانع لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على شاكر مداري بمعدل 30 دورة في الدقيقة.

بعد ذلك ، قم بتهجين غشاء PVDF بجسم مضاد مضاد ل p53 وحجب المخزن المؤقت لمدة 12 إلى 16 ساعة عند أربع درجات مئوية على خلاط معلق بمعدل 30 دورة في الدقيقة. ثم أخرج غشاء PVDF وانقله في وعاء مملوء بمحلول ملحي مخزن في Tris 20. بعد ذلك ، انقع غشاء PVDF في محلول ملحي مخزن في Tris لمدة 30 دقيقة على شاكر المداري بمعدل 45 دورة في الدقيقة.

ثم قم بتهجين غشاء PVDF بجسم مضاد مضاد للأرانب مقترن ببيروكسيداز الفجل المخفف في مانع المخزن المؤقت لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على خلاط التعليق بمعدل 30 دورة في الدقيقة. بعد ذلك ، اغسل غشاء PVDF بمحلول ملحي مخزن في Tris 20 ثلاث مرات. بعد الغسيل ، انقع غشاء PVDF في محلول ملحي مخزن في Tris 20 لمدة 30 دقيقة على خلاط التعليق بمعدل 45 دورة في الدقيقة.

ثم استبدل المحلول الملحي 20 المخزنة في تريس بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات. للحفاظ على غشاء PVDF عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى 12 ساعة. بعد ذلك ، امزج كواشف الركيزة الكيميائية المحسنة واحدا واثنين بنسبة واحد إلى واحد.

ثم قم بإزالة غشاء PVDF من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات وامسح لفترة وجيزة بجيوب الثقب لامتصاص الرطوبة الزائدة. أضف على الفور 400 ميكرولتر من الكاشف الكيميائي إلى سطح الغشاء وانتظر لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. لطخة لفترة وجيزة لتصريف الكاشف الكيميائي الزائد ، مما يمنع الغشاء من الجفاف تماما.

استخدم نظام التصوير Luminescent لكشف اللطخة. هنا تم إجراء تحليل اللطخة المناعية لإظهار تركيز إنزيم Ubc9 المطلوب لتغطية أهداف p53. هذا يدل على أن تركيز إنزيم Ubc9 يمكن أن يحقق إنزيم سومويلات p53 بشكل كاف في مقايسة SUMOylation في المختبر باستخدام ببتيدات SUMO 1 و SUMO 2.

لتحليل SUMOylated p53 ، تم فحص الغشاء بجسم مضاد مضاد ل p53. تم إجراء تحليل لطخة مناعية مماثلة لإظهار أن نصف تركيز E1 و 1/10 من إنزيمات Ubc9 مطلوبان لتحويل هدف p53 في مقايسة SUMOylation في المختبر باستخدام ببتيدات SUMO 1 و SUMO 2 و SUMO 3. هنا تم تلطيخ الغشاء ب Coomassie لإظهار بروتين K-bZIP المنقى.

تم استخدام نظام تعبير الفيروس العصبي للتعبير عن K-bZIP المنقى الذي تم تحليله على صفحة SDS باستخدام ألبومين مصل الأبقار كمعيار للمقارنة. كما تم إجراء تحليل إضافي للبقع المناعية والذي أظهر أنه عند زيادة تركيز K-bZIP ، فإنه يحفز SUMOylation ل p53 في وجود نصف كمية E1 ، و 1/10 كمية إنزيمات Ubc9 ، على التوالي. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الاحتفاظ بكل الكاشف لمقايسة SUMOylation في المختبر على الجليد ، والقيام بتخفيف السلسلة بدلا من التخفيف العملاق الواحد. ابحث عن هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الإفراط في التعبير SUMOlygase من أجل التحقق من SUMOylation في المختبر. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال SUMOylation لاستكشاف المزيد من SUMOlygase والتحقق من قوتهم في الخصوصية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعرف على SUMO e3 lygase باستخدام مقايسة المحاكاة في المختبر.