الرقم الهيدروجيني رواية حية في المختبر -تصوير بوساطة "الإنزيم Astrocyte البلعمه استخدام" مؤشر مترافق سينابتوسوميس

ويقدم هذا البروتوكول في المختبر تصوير لايف البلعمه مقايسة لقياس قدرة astrocytes متجولة. وتستخدم الفئران المنقي astrocytes و microglia جنبا إلى جنب مع سينابتوسوميس مترافق مؤشر الرقم الهيدروجيني. هذا الأسلوب يمكن الكشف عن حركية الإحاطة وتدهور في الوقت الحقيقي ويوفر منصة فحص مناسبة لتحديد العوامل تحوير astrocyte البلعمه.

الهدف العام من هذه التجربة هو اكتشاف حركية الابتلاع والتدهور في الوقت الفعلي للخلايا الدبقية ، مثل الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة ، من خلال التصوير الحي في المختبر للبلعمة في المشابك المترافقة بمؤشر الأس الهيدروجيني. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب ، مثل كيفية تنظيم بلعمة الخلايا الدبقية في الأدمغة السليمة والمريضة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا مراقبة وتحليل حركية البلعمة في الوقت الفعلي للخلايا الدبقية بشكل فعال من خلال التصوير الحي للخلايا المستنبتة في المختبر.

يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة للكشف عن العوامل والمركبات التي تنظم قدرة الابتلاع والتدهور للخلايا الدبقية. ابدأ بالطرد المركزي لعينات الجسيمات المشابكة المذابة لمدة ثلاث إلى أربع دقائق عند 21 ، 092 جم وأربع درجات مئوية. بعد شفط المواد الطافية ، أعد تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من 0.1 كربونات الصوديوم المولار لكل أنبوب ، مع إضافة ميكرولترين من مؤشر الأس الهيدروجيني إلى كل عينة بعد خلطها جيدا.

بعد دوامة لطيفة ، قم بحماية المحاليل من الضوء بأغطية رقائق الألومنيوم ، وضع العينات في شاكر ملتوي مع تحريك لطيف لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، أضف ملليلتر واحد من PBS من Dulbecco ، أو DPBS ، واجمع الجسيمات العصبية عن طريق الطرد المركزي ، وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من DPBS الطازج لكل غسلة. بعد الطرد المركزي الأخير ، أعد تعليق حبيبات الجسيمات المشبكية غير الوظيفية في 200 ميكرولتر من DPBS مكملة بنسبة 5٪ DMSO.

للتصوير الحي لابتلاع المشبك ، قم أولا بإزالة المادة الطافية من كل بئر في مزرعة الخلايا النجمية المتقاربة ، واغسل الخلايا بسرعة ثلاث مرات باستخدام مليلتر واحد من DPBS لكل غسلة. بعد الغسيل الأخير ، أضف 300 ميكرولتر من الوسط الأساسي للخلايا النجمية المناعية وخمسة ميكرولترات من المشابك المترافقة بمؤشر الأس الهيدروجيني ، بالإضافة إلى أي عوامل إضافية يمكن أن تعدل بلعمة الخلايا الدبقية. اسمح للمتشابك العصبي بالاستقرار في قيعان الآبار والالتصاق بمستقبلات الفوسفاتيديل سيرين على الخلايا النجمية عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بعد 40 دقيقة ، تخلص من المواد الطافية واغسل الآبار بسرعة ولكن برفق ثلاث مرات باستخدام مليلتر واحد من DPBS لكل غسلة. بعد الغسيل الأخير ، أضف 500 ميكرولتر من الوسط الطازج المكملة بالعوامل ذات الأهمية للآبار المناسبة وانقل اللوحة إلى أداة تصوير حية. حدد مواضع التصوير، واضبط التركيز البؤري ووقت التعريض الضوئي والسطوع وطاقة LED، واضبط تنسيق الصورة والفاصل الزمني والعدد الإجمالي للدورات للتصوير المباشر حسب الاقتضاء تجريبيا.

بعد ذلك ، ابدأ التصوير المباشر لتجارب البلعمة. في نقطة النهاية التجريبية المناسبة ، افتح برنامج تحليل تخيل واستورد تسلسل صورة الفاصل الزمني. قم بتحويل الصور إلى تدرج رمادي 8 بت وابدأ طرح الخلفية بنصف قطر شريط متدحرج يبلغ 50 بكسل.

بعد ذلك ، افتح المكون الإضافي Time Series Analyzer V3 واسحب منطقة الاهتمام إلى المكون الإضافي. في مدير منطقة الاهتمام، انقر فوق إضافة. في المكون الإضافي Time Series V3، انقر فوق Get Total Intensity.

ثم احفظ النتائج وقم بدمج البيانات. بعد تحضيرها ، تعبر المشابك العصبية عن الفوسفاتيديل سيرين على أغشيتها الخارجية ، مما يشير إلى فقدان الوظيفة ، ويمكن التعرف على ذلك بواسطة مستقبلات الفوسفاتيديل سيرين على الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة. نظرا لأن المشابك العصبية المترافقة بمؤشر الأس الهيدروجيني تكون بلعمة ، فإنها تنبعث منها فلورسنت حمراء زاهية.

لتحديد بلعمة الخلايا الدبقية ، يمكن قياس مساحة إشارة التألق الأحمر ، أو مؤشر البلعمة. على الرغم من أن الخلايا النجمية فعالة في البلعمة في أعداد كبيرة من الجسيمات العصبية المترافقة بمؤشر الأس الهيدروجيني ، إلا أن الخلايا الدبقية الصغيرة تكون أسرع في ابتلاع وتحلل المشابك. ومن المثير للاهتمام أن العوامل التي تفرز الخلايا النجمية ، الموجودة في الوسط المكيف للخلايا النجمية ، ضرورية لزيادة البلعمة بوساطة الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة.

علاوة على ذلك ، أظهرت الخلايا النجمية بالضربة القاضية للفأر MEGF10 ضعفا كبيرا في قدرة البلعمة مقارنة بالخلايا البرية. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأعصاب وبيولوجيا الخلايا الدبقية لاستكشاف الآليات التي ينطوي عليها تعديل بلعمة الخلايا الدبقية كطريقة محتملة لعلاج الاضطرابات العصبية المختلفة.