دراسة "مرض السكر من خلال عيون" من الأسماك: ميكروديسيكتيون، والتصور، وتحليل tg(fli:EGFP) الكبار "الزرد الشبكية المفرج"

الهدف العام من بروتوكول التشريح هذا لالأوعية الدموية الشبكية لأسماك الزرد البالغة هو توفير قراءة سريعة في إعدادات أمراض الأوعية الدموية طويلة المدى المرتبطة بتكوين الأوعية الجديدة والتغيرات الهيكلية عبر التألق أو الفحص المجهري متحد البؤر بالمسح بالليزر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال مضاعفات الأوعية الدموية الدقيقة مثل تطور اعتلال الشبكية السكري. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تقديم وتحليل retinovasculature بالكامل في العمليات الفسيولوجية والمرضية دون أي تطبيق للتألق بين الأوعية الدموية بطريقة سريعة وموحدة نسبيا.

للبدء ، انقل ستة ملليلتر من محلول PFA PBS المحضر حديثا بنسبة أربعة بالمائة لكل عينة إلى آبار ستة ألواح آبار. بعد القتل الرحيم لسمك الزرد البالغ وفقا لبروتوكول النص ، ضعه على مناشف ورقية جديدة وجففه. استخدم مشرطا واقطع الرؤوس خلف الرأس.

ثم انقل الرؤوس مباشرة إلى آبار المثبت الطازج. قم بتخزين الأطباق التي تحتوي على رؤوس الأسماك على أربع درجات مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل للتأكد من أن المثبت يخترق طبقات الشبكية العميقة. مع تسخين اثنين بالمائة من agarose ، املأ طبق بتري حتى الثلث وانتظر حتى يصبح الأجار متماسكا.

قم بتغطية لوحة الأجار ب X PBS لإنشاء مساحة عمل لتشريح العينين. انقل العينة الثابتة إلى طبق بتري. ومن خلال إمساك الرأس على السطح المقطوع باستخدام ملقط واحد ، أدخل آخر ، مثبتا معا ملاقط أسفل مقلة العين في التجويف المداري.

افتح الملقط أسفل العين ببطء وامسك العصب البصري. ثم المسيل للدموع بعناية وفصل العين. لإزالة أي من العضلات المستقيمة الأربعة وعضلتين مائلتين خارج العين متصلتين بالعين بالإضافة إلى الأنسجة خارج العين المتبقية التي تربط العين بالتجويف المداري ، أمسك العين من خلال ملاقط نصف مغلقة وأمسك الهيكل بالملاقط الأخرى استخدم حركة قطرية لتمزيقها بهدوء.

بعد ذلك ، استخدم إبرة يمكن التخلص منها قياس 27 لثقب القرنية في النطاق الخارجي. من خلال هذه الفتحة ، استخدم كلا الملقطين لتثبيت القرنية وتمزيقها قليلا. ثم اعمل بعناية لإنشاء تمزق مركزي حول حجم التلميذ المعني.

اضغط على جانب القرنية من الكرة الأرضية عند حافة القرنية الخارجية فوق القزحية. سيؤدي ذلك إلى إنشاء انبعاج صغير ودفع العدسة إلى ارتفاع تمزق القرنية. ثم مرر الملقط تحت العدسة وقم بإزالته.

بعد ذلك ، اقلب العين رأسا على عقب بحيث يكون العصب البصري متجها لأعلى. لاحظ أن الصلبة والقرنية متصلتان ويشكلان سترة ليفية لبصلة العين لحماية شبكية العين على شكل كوب. هذه القشرة ، التي يشار إليها باسم صلبة القرنية ، تجنيب المنطقة المحيطة بالعصب البصري.

أدخل إبرة عند هذا التوقف لإنشاء فتحة بين الصلبة والشبكية. ثم باستخدام هذا الوصول مع كلا الملقطين ، قم بتمزيق الصلبة محوريا بعناية إلى شرائح لزيادة الفتحة حول العصب البصري. احرص على الحفاظ على صلبة القرنية سليمة عند الانتقال إلى محيط جانب القرنية.

قبل إزالة الصلبة القرنية من الأنسجة المتبقية داخل العين ، حاول أن تشديد أي اتصالات لأن التعلق بالهياكل الأخرى سيكون نقطة حرجة. ثم أمسك الصلبة بملاقط واحدة وبالإمساك بالعصب البصري بالآخر والسحب بعيدا ، قم بإزالة الصلبة القرنية بالكامل من العين وتخلص منها. ستوفر هذه الخطوة بنية على شكل كوب تتكون من العنبية وشبكية العين التي تحتوي على الأوعية الدموية الشبكية.

بعد ذلك ، قم بإنشاء تمزق في الطبقة المشيمية و RPE عن طريق إمساك إبرة قياس 27 جانبا بالكوب المتبقي أثناء تخريد السطح الخارجي بحافة طرف الإبرة. استخدم التمزق كنقطة وصول للقبضة على الطبقة المشيمية وطبقة RPE واستخدم كلا الملقطين لتمزيقها إلى خطوط مع الحفاظ على الاتصال بقزحية العين سليمة. بعد ذلك ، قم بتشغيل ملاقط واحدة تحت القزحية وحركها في دائرة من الخارج أثناء خلق التوتر عن طريق سحب الطبقة المشيمية وطبقة RPE المتوقفة وفصل الهيكل المدمج.

إذا تعذر إزالة أجزاء من القزحية والبقاء متصلة بشبكية العين على شكل كوب بعد إزالة الطبقة المشيمية وطبقة RPE ، فاستخدم نقطة انهيار طبيعية أخرى تظهرها عين الزرد البالغة داخل طبقة المستقبلات الضوئية. بطريقة مماثلة يتم عرضها فقط لإزالة القزحية. اكشط الشبكية المتبقية على شكل كوب للحث على انقطاع في طبقة المستقبلات الضوئية.

ثم استخدم الوصول الذي تم إنشاؤه لإزالة الطبقة مع الحفاظ على الاتصال المحتمل بالقزحية سليمة. بعد ذلك ، قم بتشغيل الملقط تحت القزحية واستمر في دائرة كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو لفصل الهيكل المدمج. من الأهمية بمكان فصل القزحية عن أنسجتها الأساسية بطريقة معقولة لأنها ستمنع التألق مباشرة فوق الدائرة البصرية الداخلية أثناء تصور الأوعية.

يمكن أن يؤدي النهج المباشر بشكل مفرط إلى كسر السفينة. ثم استخدم مقص زنبركي للتشريح المجهري بحافة قطع مستقيمة من نقطتين وخمسة ملليمترات لقطع العصب البصري في أقرب وقت ممكن من شبكية العين. سيسمح ذلك بتركيب مسطح أفضل للأنسجة.

لتركيب وتصور الأوعية الدموية الشبكية ، استخدم X PBS لغسل شبكية العين المقطعة مرتين لمدة خمس دقائق لكل منهما. ضع قطرة من PBS على شريحة زجاجية. ثم باستخدام ملعقة معملية بنهاية ملعقة صغيرة ، انقل شبكية العين إلى القطرة.

باستخدام الملقط ، حافظ على الأنسجة في مكانها أثناء استخدام مشرط لقطع الهيكل على شكل كوب لإنشاء شكل مسطح بأربع بتلات أو خمس بتلات ، اعتمادا على حجم شبكية العين. باستخدام قطعة رقيقة من الورق ، تمتص البقية فوق PBS ، مع الحرص على عدم لمس شبكية العين. ثم قم بتغطية شبكية العين المثبتة بشكل مسطح في وسط التثبيت وقم بتغطيتها بغطاء الغطاء.

كن منتبها لعدم تكوين رغوة لأن فقاعات الهواء يمكن أن تشوه تصور الأوعية الشبكية. استخدم طلاء الأظافر لإغلاق الغطاء. أخيرا ، قم بإجراء الفحص المجهري الفلوري أو المسح الضوئي بالليزر لتصور الأوعية الدموية في الشبكية.

يظهر هنا مثال مورفولوجي لالأوعية الدموية في الشبكية في أسماك الزرد EGFP ذات الذباب البالغ المعدلة وراثيا والتي تم تصويرها باستخدام مجهر مضان ومثال ثان تم تصويره باستخدام مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر الذي يقلل من تألق الخلفية. يظهر هيكل الشبكية المكشوف نمطا منظما للغاية. يخترق الشريان البصري شبكية العين في رأس العصب البصري وينتشر في معظم العينات إلى خمسة إلى سبع أوعية رئيسية.

ثم تتفرع الأوعية الرئيسية إلى سلسلة من الأروقة وتتصل بالدائرة البصرية الداخلية أو اللجنة الأولمبية الدولية ، والتي تسمى أيضا الوريد المحيطي ، وتحيط بالقرص البصري في محيط شبكية العين المسطحة. تتكون شبكية الزرد البالغة من الطبقات التالية من الداخل إلى الخارج. طبقة الخلية العقدية ، الطبقة الداخلية ، الطبقة النووية الداخلية ، الطبقة الضفيرية الخارجية ، الطبقة النووية الخارجية ، الطبقة المستقبلة للضوء ، والظهارة المصطبغة في الشبكية.

هنا تقدير معلمات الأوعية الدموية من تصور الأوعية الدموية في الشبكية. تقع الأوعية الدموية الداخلية للشبكية على طبقة الخلية العقدية بينما ترتبط الشعيرات الدموية الودية بظهارة الشبكية المصطبغة. بمجرد التدريب ، يمكن إجراء هذه التقنية في أقل من 20 دقيقة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تتدرب بانتظام لأن الغياب المطول عن التحضير يقلل من نتيجة سلامة الوعاء. بعد هذا الإجراء ، يمكن تحليل مرض السكري وأمراض الأوعية الدموية العصبية في أسماك الزرد البالغة.