كشف الفسفرة Rab10 بالنشاط LRRK2 باستخدام مخزونات النشر الاستراتيجي-الصفحة مع علامة ربط الفوسفات

الهدف العام من هذه التجربة هو اكتشاف فسفرة Rab10 بواسطة LRRK2 باستخدام SDS-PAGE مع علامة ربط الفوسفات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أبحاث باركنسون مثل كيفية تأثير طفرات المرض في LRRK2 على فسفرة Rab10. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن للمرء أن يكون لديه تقدير تقريبي لقياس الفسفرة Rab10 باستخدام لطخة غربية بسيطة.

العديد من خطوات هذا البروتوكول قياسية إلى حد ما ويتم وصفها بتفصيل كاف من خلال بروتوكول النص المصاحب لهذا الفيديو. هنا ، نريد أن نوضح لك الخطوات التي تستفيد أكثر من التعليمات المرئية. قم بإعداد لوحات من خلايا HEK293 المنقولة كما هو موضح في بروتوكول النص.

مع وجود الألواح على الجليد ، استنشق الوسائط وتخلص منها. بعد ذلك ، أضف ملليلترين من DPBS بعناية إلى زاوية كل لوحة وهز الألواح لنشر المحلول. ثم قم بإزالة DPBS وتجاهله.

بعد ذلك ، أضف إلى كل لوحة 100 ميكرولتر من محلول التحلل. قم بإمالة اللوحة واستخدم مكشطة لنشر المخزن المؤقت وتحرير محللة الخلية. ثم قم بشفط المحللات ونقلها إلى أنابيب ميكروفوجي مبردة مسبقا على الثلج وانتظر 10 دقائق.

بعد ذلك ، قم بجمع محللات الخلايا الخالية من الحطام عن طريق الطرد المركزي للأنابيب ونقل المواد الطافية إلى أنابيب جديدة على الجليد. ثم قم بقياس تركيزات البروتين في المحللات التي تم تطهيرها باستخدام مقايسة برادفورد. للحصول على بيانات التركيز ، قم بإعداد عينة 100 ميكرولتر من المحللات لتحليل الجل.

قم بإعداد محللات أكثر كثافة لقياس Rab10 الذاتي مقارنة بالهيماجلوتينين المعبر عنه المفرط Rab10. الانتهاء من تحضير العينات عن طريق احتضانها على حرارة 100 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم قم بتخزين العينات تحت درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لحين الحاجة لمدة تصل إلى ستة أشهر أو أكثر.

للبدء ، قم بإعداد خلايا SDS-PAGE وفقا لبروتوكول النص. ثم قم بتحميل الجل في الخزان وقم بتثبيته بمشابك الموثقة. بعد ذلك ، املأ الخزان بمخزن مؤقت قيد التشغيل وقم بإزالة فقاعات الهواء في الآبار وتحت الجل باستخدام إبرة متصلة بحقنة.

أضف الآن كلوريد المنغنيز إلى العينات وقم بتدويرها لإزالة الرواسب. ثم قم بتحميل الجل بكميات متساوية من العينة ، 10 ميكروغرام من البروتين لتحليل الهيماجلوتينين Rab10 أو 30 ميكروغراما من البروتين لتحليل Rab10 الداخلي. قم بتحميل الممرات الفارغة بعينة عازلة تحتوي على كلوريد المنغنيز.

استكمل أيضا علامة الوزن الجزيئي بالمخزن المؤقت وكلوريد المنغنيز لجعلها بنفس حجم العينات. ابدأ الآن في تشغيل الجل عند 50 فولت. بعد كومة العينة ، قم بزيادة الجهد إلى 120 للحصول على فصل.

عندما تصل مقدمة الصبغة إلى قاع المواد الهلامية ، اقتل الجهد. بعد ذلك ، اغسل الجل ثلاث مرات على النحو التالي. قم بتحميل جل الفصل في حمام من المخزن المؤقت للنقل النظيف مع إضافة EDTA و SDS.

ثم اتركه يتأرجح على شاكر لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ثلاث غسلات ، قم بإجراء غسيل آخر باستخدام مخزن النقل المؤقت مع SDS المضاف ولكن بدون EDTA. ثم انقل الجل باستخدام خزان مبلل.

قم بتحميل الخزان في صندوق رغوي مملوء بالماء المثلج ، وقم بتوصيل الخزان بمصدر طاقة وابدأ النقل. يعد النقل الطويل مع التبريد الفعال أمرا ضروريا لهذا الإجراء. بعد النقل ، تحقق من النقل عن طريق تلطيخ الغشاء باستخدام Ponceau S ، متبوعا بغسيل في TBST وفقا لبروتوكول النص.

بعد ذلك ، قم بتطبيق كتلة. اغمر اللطخة في TBST اللبني وهز اللطخة على شاكر لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بإزالة محلول الحجب والتخلص منه وتطبيق محلول الجسم المضاد الأساسي.

الآن هز الغشاء بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، قم بإزالة محلول الجسم المضاد الأساسي. ثم اغسل الغشاء ب TBST الطازج ثلاث مرات كما كان من قبل.

بعد الغسيل ، اغمر اللطخة في محلول الجسم المضاد الثانوي واحتضن الغشاء على الروك لمدة ساعة تقريبا في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، اغسل الغشاء باستخدام TBST ثلاث مرات مرة أخرى. الآن قم بتطوير الغشاء.

أضف ملليلتر واحد من محلول ECL إلى ورقة كبيرة من غلاف بلاستيكي. ثم ضع الغشاء في ECL واقلبه بسرعة لترطيب كلا الجانبين. بعد ذلك ، ارفع الغشاء واتركه يستنزف.

بعد التصريف ، اترك إحدى الحواف تلمس منشفة ورقية لمدة خمس ثوان تقريبا للمساعدة في التخلص من المحلول الزائد. ثم لف الغشاء بغشاء شفاف صلب بدون تجاعيد وانقله إلى صينية سوداء للتصوير. تم نقل خلايا HEK293 باستخدام الهيماجلوتينين Rab10 من النوع البري و 3xFLAG-LRRK2.

اختبار كيناز من النوع البري غير نشط في طفرات مرض باركنسون العائلية ل LRRK2. أدى الإفراط في التعبير المشترك ل LRRK2 و Rab10 إلى تحول كبير في النطاق في هلام P-tag. في المقابل ، أدى التعبير المشترك مع متحولة كيناز غير نشطة إلى عدم حدوث تغيير في حركة Rab10 ، مما يدل على أن كيناز هو سبب تحول النطاق.

كما هو متوقع أيضا ، زادت طفرات باركنسون العائلية من تحول النطاق. تم استخدام نظام هلام P-tag أيضا لتحليل الخلايا الليفية الجنينية 3T3-Albino السويسرية المعالجة بمثبط LRRK2. اختفى تحول النطاق المقابل ل Rab10 الداخلي الفسفوري عندما عولجت الخلايا ب GSK2578215A.

تم إجراء نفس الاختبار أيضا باستخدام خلايا A549 البشرية. في هذه التجارب ، تم التحقق من فعالية مثبط LRRK2 باستخدام الجسم المضاد للسيرين 935 LRRK2 المضاد للفيروسات وهو علامة راسخة لتثبيط LRRK2. بمجرد إتقانها ، لا تحتاج هذه التقنية إلا إلى 14 دقيقة إضافية مقارنة بإجراء النشاف الغربي المعتاد لغسل المواد الهلامية قبل النقل.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل قياس الطيف الكتلي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل ما إذا كانت طفرات FPD تفسفور نفس بقايا Rab10. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أبحاث باركنسون لاستكشاف المستويات الداخلية لفسفرة Rab10 في الخلايا المستنبتة وكذلك في الأنسجة. لا تنس أن العمل مع الميكروسيستين المضاف إلى المخزن المؤقت للتحلل يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة أثناء تحضير محللات الخلايا.