تعبير عابر "للجينات الأجنبية" في "خلايا الحشرات" (sf9) "البروتين المقايسة الوظيفية"

الهدف العام لنظام التعبير عن البروتين الناجم عن الصدمة الحرارية هو تقييم نشاط البروتين المضاد لموت الخلايا المبرمج في بروتينين يحتمل أن يكون معاديا وظيفيا في خلايا الحشرات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول وظائف وأنشطة البروتينات المرشحة في التكنولوجيا الحيوية والبروتينات ، مثل أنشطتها المضادة لموت الخلايا المبرمج وتفاعلات البروتين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن توقيت التعبير الجيني يتم التحكم فيه عن طريق تحريض الصدمة الحرارية.

لذلك يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة للحالة الوظيفية للبروتين. يمكن تطبيقه أيضا على أنظمة أخرى ، مثل تعبير بروتين الثدييات. تزرع خلايا الحشرات Spodoptera frugiperda ، أو Sf9 ، المستخدمة في هذا البروتوكول في وسط زراعة الخلايا في قوارير زراعة الخلايا 25 سم مربع عند 28 درجة مئوية.

هز قارورة زراعة الخلايا لفصل الخلايا عن القارورة. ثم تحقق تحت المجهر الضوئي للتأكد من أن حوالي 80٪ من الخلايا منفصلة. انقل 50٪ من تعليق الخلية إلى قارورة ثقافة خلية جديدة تبلغ مساحتها 25 سم مربع ، واترك الخلايا تلتصق في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.

بعد 15 دقيقة ، استبدل الوسط بخمسة ملليلتر من وسط الاستزراع الطازج ، وتنمو في حاضنة عند 28 درجة مئوية. اعتمادا على نمو الخلية ، قم بتمرير الخلايا كل يومين إلى ثلاثة أيام. قبل حصاد خلايا Sf9 ، من المهم فحص الخلايا تحت المجهر الضوئي للتأكد من عدم وجود تلوث بالبكتيريا أو الكائنات الحية الدقيقة الأخرى.

لحصاد خلايا Sf9 ، قم بهز قارورة الثقافة لفصل الخلايا ، ثم انقل تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 15 ملليلترا. باستخدام ماصة P10 ، انقل 10 ميكرولترات من تعليق الخلية إلى مقياس الدمى ، واحسب رقم الخلية تحت المجهر الضوئي. ضع اللوحة ثلاث مرات من 10 إلى الخلايا الخامسة في كل بئر من صفيحة 24 بئرا ، واتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.

بعد 15 دقيقة ، استبدل الوسط ب 0.5 مل من وسط الطلاء. تحضير الوصي على تعداء الخلية. لكل تعداء ، قم بتخفيف ثمانية ميكرولترات من كاشف تعداء الخلية مع 100 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا الخالي من المصل ، والدوامة لمدة ثانية واحدة للخلط.

في هذه الدراسة ، سيتم التعبير عن ثلاثة اقتطاعات مختلفة للجين الفيروسي العصبي ، مثبط موت الخلايا المبرمج 3 ، أو IAP3 ، تحت سيطرة محفز الصدمة الحرارية ذبابة الفاكهة 70 ، IAP3 كامل الطول ، اقتطاع يفتقر إلى مجال RING ، والاقتطاع الذي يفتقر إلى مجال BIR. أضف ميكروغرامين من كل حمض نووي بلازميد إلى 100 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا الخالي من المصل ، واخلطه عن طريق الدوامة لمدة ثانية واحدة. قم بإعداد تحكم إيجابي أيضا.

اجمع بين الحمض النووي البلازميد المخفف وكاشف تعداء الخلية المخفف ، واخلطه عن طريق الدوامة. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. باستخدام ماصة P1000 ، أضف 210 ميكرولتر من كل خليط كاشف تعداء الحمض النووي بالتنقيط على الخلايا.

احتضن عند 28 درجة مئوية لمدة خمس ساعات. بعد خمس ساعات ، استبدل وسط الطلاء ب 0.5 مل من وسط زراعة الخلايا ، ثم أغلق اللوحة المكونة من 24 بئرا بشريط لاصق. احتضان عند 28 درجة.

في اليوم التالي ، صدمة حرارية للحث على التعبير عن البروتين عن طريق تعويم اللوحة في حمام مائي 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة ، أعد الطبق المكون من 24 بئرا إلى حاضنة 28 درجة مئوية. يتم تأكيد تعبير البروتين لاحقا بواسطة اللطخة الغربية كما هو موضح في بروتوكول النص.

لفحص موت الخلايا المبرمج للخلايا الناجم عن الجينات ، قم أولا بإعداد خلايا Sf9 كما هو موضح سابقا. بعد ذلك ، قم بنقل الخلايا بنفس الطريقة السابقة ، ولكن قم بتضمين ميكروغرام واحد من البلازميد الذي يحتوي على جين محفز موت الخلايا المبرمج في كل تفاعل تعداد. احتضن عند 28 درجة مئوية لمدة خمس ساعات ، واستبدل الوسط ، واحتضنه لمدة 16 ساعة.

حرارية للخلايا المنقولة عند 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. احتضان الخلايا عند 28 درجة مئوية لمدة خمس ساعات قبل إجراء مقايسة بقاء الخلية. بالنسبة لموت الخلايا المبرمج الناجم عن المواد الكيميائية ، ضع صفيحة واحدة في 10 إلى خلايا Sf9 الست في كل بئر من صفيحة مكونة من ستة آبار.

اتركيه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة ، ثم استبدلي الوسط بمليلتر واحد من وسط الطلاء. قم بنقل الخلايا بأربعة ميكروغرامات من كل حمض نووي بلازميد. بعد خمس ساعات ، استبدل وسط الطلاء بمليلتر واحد من وسط زراعة الخلايا ، واحتضان الخلايا عند 28 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.

ثم صدمة حرارية عند 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. احتضان الخلايا عند 28 درجة مئوية لمدة خمس ساعات بعد الصدمة الحرارية. ثم عالج الخلايا المنقولة بالأكتينومايسين D للحث على موت الخلايا المبرمج.

احتضان عند 28 درجة مئوية لمدة 16 ساعة قبل إجراء فحص صلاحية الخلية. ابدأ هذا الإجراء بغسل الخلايا المعالجة. قم بإزالة الوسط من كل بئر ، وأضف ملليلتر واحد من PBS ، واتركه لمدة دقيقة واحدة.

اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS بهذه الطريقة. أعد تعليق الخلايا في كل بئر بملليلتر واحد من PBS يحتوي على 04٪ تريبان بلو ، وصمة عار في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب ميكروفوج سعة 1.5 ملليلتر.

انقل 10 ميكرولترات من تعليق الخلية الملطخة باللون الأزرق إلى مقياس الدم ، واحسب الخلايا السليمة القابلة للحياة تحت المجهر الضوئي. أخيرا ، قم بإجراء التحليل الإحصائي كما هو موضح في بروتوكول النص. تم الإفراط في التعبير عن الطول الكامل واثنين من اقتطاع IAP3 من Lymantria xylina MNPV في خلايا Sf9 ، وتم إجراء اللطخة الغربية على محللات الخلية لتأكيد التعبير عن البروتين.

تم تضمين البروتين المضاد للموت المبرمج Ac-P35 كعنصر تحكم إيجابي. يمكن اكتشاف جميع البروتينات في الخلايا المنقولة إما بعد ساعة واحدة أو خمس ساعات من الصدمة الحرارية ، مع تعبير أعلى بعد خمس ساعات. يمكن تكييف هذا النظام لتقييم النشاط المضاد لموت الخلايا المبرمج.

بالنسبة لموت الخلايا المبرمج الناجم عن الجينات ، تم نقل محفز موت الخلايا المبرمج ذبابة الفاكهة ريبر مع تركيبات البلازميد الجيني المستهدف إلى خلايا Sf9 ، والتي تعرضت لاحقا للصدمة الحرارية لتنشيط التعبير الجيني. بالمقارنة مع ذبابة الفاكهة حصادة ، أظهر العنصر الإيجابي نشاطا عاليا مضادا لموت الخلايا المبرمج ، حيث وصل إلى 80٪ من معدل البقاء. أظهرت التركيبات الأخرى تأثيرات مختلفة على النشاط المضاد لموت الخلايا المبرمج.

بالنسبة لموت الخلايا المبرمج للخلايا الناجم عن المواد الكيميائية ، تم نقل بنية واحدة فقط إلى خلايا Sf9 ، وأضيف الأكتينومايسين D بعد خمس ساعات من الصدمة الحرارية. بالمقارنة مع التحكم الإيجابي أو التحكم السلبي ، أظهرت التركيبات الأخرى تأثيرات مختلفة على النشاط المضاد لموت الخلايا المبرمج. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون يومين إلى ثلاثة أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الامتثال لقواعد تشغيل زراعة الخلايا في التدفق الصفحي والتحقق من حالة الخلايا بجد. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل الترسيب المناعي المشترك ، للإجابة على أسئلة إضافية ، مثل ما إذا كان هناك أي تفاعل بين البروتينين المعبر عنه في خلايا الحشرات. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التكنولوجيا الحيوية لاستكشاف وظائف البروتين في أو الكائنات الحية الدقيقة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام هذا النظام للتعبير عن البروتين الغريب أو تقييم البروتينات التي يحتمل أن تكون معادية وظيفيا في خلايا الحشرات. لا تنس أن العمل مع بعض المواد الكيميائية ، مثل الأكتينومايسين D ، يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل ارتداء القفازات ، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.