Name: بروتوكول لتتبع في الوقت الحقيقي 3D الجسيمات مفردة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: اكتشف بروتوكول تتبع الجسيمات المفردة ثلاثية الأبعاد في الوقت الحقيقي باستخدام المجهر الضوئي المتقدم. تتيح هذه التقنية مراقبة الجسيمات النانوية الفلورية والفيروسات الفردية باستمرار حتى في ظروف الإضاءة المنخفضة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل بالمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة "المعاهد الوطنية للصحة" تحت رقم جائزة R35GM124868 وجامعة ديوك.

<ol><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li>
<li>Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Fast Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+three-dimensional+super-resolution+imaging+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells.</a> Nat. Methods. 8 (6), 499-505 (2011).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li>
<li>Shtengel, G., Galbraith, J. A., Galbraith, C. G., Lippincott-Schwartz, J., Gillette, J. M., Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+fluorescent+super-resolution+microscopy+resolves+3D+cellular+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 3125-3130 (2009).</li>
<li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+photoactivated+localization+microscopy+of+nanoscale+adhesion+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics.</a> Nat. Methods. 5 (5), 417(2008).</li>
<li>Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+3D+microscopy+of+live+whole+cells+using+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination.</a> Nat. Methods. 8 (12), 1044(2011).</li>
<li>Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+video+microscopy+of+live+cells+by+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination.</a> Nat. Methods. 6 (5), 339(2009).</li>
<li>Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., Shao, L., Winoto, L., Kner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction+multicolor+imaging+of+the+nuclear+periphery+with+3D+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy.</a> Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198, 82-87 (2000).</li>
<li>Persson, F., Bingen, P., Staudt, T., Engelhardt, J., Tegenfeldt, J. O., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Nanoscopy+of+Single+DNA+Molecules+by+Using+Stimulated+Emission+Depletion+%28STED%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Nanoscopy of Single DNA Molecules by Using Stimulated Emission Depletion (STED).</a> Angew. Chem. 50 (24), 5581-5583 (2011).</li>
<li>Hein, B., Willig, K. I., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulated+emission+depletion+%28STED%29+nanoscopy+of+a+fluorescent+protein-labeled+organelle+inside+a+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent protein-labeled organelle inside a living cell.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14271-14276 (2008).</li>
<li>Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy+with+diffraction+resolution+barrier+broken+by+stimulated+emission%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).</li>
<li>Welsher, K., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-resolution+3D+visualization+of+the+early+stages+of+cellular+uptake+of+peptide-coated+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nano%22%5BJournal%5D)">Multi-resolution 3D visualization of the early stages of cellular uptake of peptide-coated nanoparticles.</a> Nat. Nano. 9 (3), 198-203 (2014).</li>
<li>Welsher, K., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+behavior+of+molecules+in+biological+systems%3A+breaking+the+3D+speed+barrier+with+3D+multi-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discuss%22%5BJournal%5D)">Imaging the behavior of molecules in biological systems: breaking the 3D speed barrier with 3D multi-resolution microscopy.</a> Faraday Discuss. 184 (0), 359-379 (2015).</li>
<li>Xu, C. S., Cang, H., Montiel, D., Yang, H. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jp0671796">Rapid and quantitative sizing of nanoparticles using three-dimensional single-particle tracking.</a> J. Phys. Chem. C. 111 (1), 32-35 (2007).</li>
<li>Cang, H., Xu, C. S., Montiel, D., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guiding+a+confocal+microscope+by+single+fluorescent+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Guiding a confocal microscope by single fluorescent nanoparticles.</a> Opt. Lett. 32 (18), 2729-2731 (2007).</li>
<li>Cang, H., Wong, C. M., Xu, C. S., Rizvi, A. H., Yang, H. <a target="_blank" href="http://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.2204652">Confocal three dimensional tracking of a single nanoparticle with concurrent spectroscopic readouts.</a> Appl. Phys. Lett. 88 (22), 223901(2006).</li>
<li>Han, J. J., Kiss, C., Bradbury, A. R. M., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-Resolved%2C+Confocal+Single-Molecule+Tracking+of+Individual+Organic+Dyes+and+Fluorescent+Proteins+in+Three+Dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Time-Resolved, Confocal Single-Molecule Tracking of Individual Organic Dyes and Fluorescent Proteins in Three Dimensions.</a> ACS Nano. 6 (10), 8922-8932 (2012).</li>
<li>Wells, N. P., Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Phipps, M. E., Cutler, P. J., Lidke, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-Resolved+Three-Dimensional+Molecular+Tracking+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Time-Resolved Three-Dimensional Molecular Tracking in Live Cells.</a> Nano Lett. 10 (11), 4732-4737 (2010).</li>
<li>Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tracking+of+individual+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tracking of individual quantum dots.</a> Appl. Phys. Lett. 91 (22), (2007).</li>
<li>McHale, K., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecular+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy+in+a+Feedback+Tracking+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Intramolecular Fluorescence Correlation Spectroscopy in a Feedback Tracking Microscope.</a> Biophys. J. 99 (1), 313-322 (2010).</li>
<li>McHale, K., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja906979j">Precise Characterization of the Conformation Fluctuations of Freely Diffusing DNA: Beyond Rouse and Zimm.</a> J. Am. Chem. Soc. 131 (49), 17901-17907 (2009).</li>
<li>McHale, K., Berglund, A. J., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+Dot+Photon+Statistics+Measured+by+Three-Dimensional+Particle+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Quantum Dot Photon Statistics Measured by Three-Dimensional Particle Tracking.</a> Nano Lett. 7 (11), 3535-3539 (2007).</li>
<li>Juette, M. F., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Tracking+of+Single+Fluorescent+Particles+with+Submillisecond+Temporal+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution.</a> Nano Lett. 10 (11), 4657-4663 (2010).</li>
<li>Katayama, Y., Burkacky, O., Meyer, M., Bräuchle, C., Gratton, E., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Nanomicroscopy+via+Three-Dimensional+Single-Particle+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">Real-Time Nanomicroscopy via Three-Dimensional Single-Particle Tracking.</a> ChemPhysChem. 10 (14), 2458-2464 (2009).</li>
<li>Perillo, E. P., Liu, Y. -L., Huynh, K., Liu, C., Chou, C. -K., Hung, M. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+and+high-resolution+three-dimensional+tracking+of+single+particles+using+nonlinear+and+multiplexed+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination.</a> Nat Commun. 6, (2015).</li>
<li>Hou, S., Lang, X., Welsher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+real-time+3D+single-particle+tracking+using+a+dynamically+moving+laser+spot%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Robust real-time 3D single-particle tracking using a dynamically moving laser spot.</a> Opt. Lett. 42 (12), 2390-2393 (2017).</li>
<li>Chenouard, N., Smal, I., de Chaumont, F., Maska, M., Sbalzarini, I. F., Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Objective+comparison+of+particle+tracking+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Objective comparison of particle tracking methods.</a> Nat Meth. 11 (3), 281-289 (2014).</li>
<li>Shechtman, Y., Weiss, L. E., Backer, A. S., Sahl, S. J., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+3D+scan-free+multiple-particle+tracking+over+large+axial+ranges+with+Tetrapod+point+spread+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Precise 3D scan-free multiple-particle tracking over large axial ranges with Tetrapod point spread functions.</a> Nano Lett. 15 (6), 4194-4199 (2015).</li>
<li>Lee, H. -lD., Sahl, S. J., Lew, M. D., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+double-helix+microscope+super-resolves+extended+biological+structures+by+localizing+single+blinking+molecules+in+three+dimensions+with+nanoscale+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">The double-helix microscope super-resolves extended biological structures by localizing single blinking molecules in three dimensions with nanoscale precision.</a> Appl. Phys. Lett. 100 (15), 153701(2012).</li>
<li>Pavani, S. R. P., Thompson, M. A., Biteen, J. S., Lord, S. J., Liu, N., Twieg, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional%2C+single-molecule+fluorescence+imaging+beyond+the+diffraction+limit+by+using+a+double-helix+point+spread+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 2995-2999 (2009).</li>
<li>Sancataldo, G., Scipioni, L., Ravasenga, T., Lanzanò, L., Diaspro, A., Barberis, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.osapublishing.org/optica/abstract.cfm?uri=optica-4-3-367">Three-dimensional multiple-particle tracking with nanometric precision over tunable axial ranges.</a> Optica. 4 (3), 367-373 (2017).</li>
<li>Balzarotti, F., Eilers, Y., Gwosch, K. C., Gynnå, A. H., Westphal, V., Stefani, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanometer+resolution+imaging+and+tracking+of+fluorescent+molecules+with+minimal+photon+fluxes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes.</a> Science. 355 (6325), 606(2017).</li>
<li>Duocastella, M., Theriault, C., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+particle+tracking+via+tunable+color-encoded+multiplexing%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional particle tracking via tunable color-encoded multiplexing.</a> Opt. Lett. 41 (5), 863-866 (2016).</li>
<li>Duocastella, M., Sun, B., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+imaging+of+multiple+focal+planes+for+three-dimensional+microscopy+using+ultra-high-speed+adaptive+optics%5BTitle%5D)+AND+%22BIOMEDO%22%5BJournal%5D)">Simultaneous imaging of multiple focal planes for three-dimensional microscopy using ultra-high-speed adaptive optics.</a> BIOMEDO. 17 (5), (2012).</li>
<li>Mermillod-Blondin, A., McLeod, E., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+varifocal+imaging+with+a+tunable+acoustic+gradient+index+of+refraction+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">High-speed varifocal imaging with a tunable acoustic gradient index of refraction lens.</a> Opt. Lett. 33 (18), 2146-2148 (2008).</li>
<li>Wang, Q., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+strategy+for+trapping+single+fluorescent+molecules+in+solution+using+the+ABEL+trap%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+B%22%5BJournal%5D)">Optimal strategy for trapping single fluorescent molecules in solution using the ABEL trap.</a> Appl. Phys. B. 99 (1), 23-30 (2010).</li>
<li>Fields, A. P., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+tracking+of+a+Brownian+particle%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Optimal tracking of a Brownian particle.</a> Opt. Express. 20 (20), 22585-22601 (2012).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+Nanometer+Localization+Analysis+for+Individual+Fluorescent+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes.</a> Biophys. J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
</ol>

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.

على الرغم من أن العديد من أصناف الجسيمات واحدة 3D تتبع أساليب ظهرت في السنوات الأخيرة، تتبع في الوقت الحقيقي قوية لنشر عالية السرعة 3D أسعار العد فوتون منخفضة مع إعداد بسيطة لا تزال تشكل تحديا، مما يحد من تطبيقه على الأهمية البيولوجية مشاكل. وصف الأسلوب 3D-ديبلوت في هذه عناوين بروتوكول هذه التحديات طرق عدة. أولاً، يتم تبسيط مسارات الإثارة وكشف إلى حد كبير بالمقارنة مع تطبيقات أخرى جعل المحاذاة بسيطة وقوية. وثانيا، الليزر تتحرك بقعة وموضع تقدير خوارزمية تقديم تقديرات موقف دقيق لدائرة التغذية الاسترجاعية، مما يجعل ردود الف...

ظهور تقنيات التصوير المتقدمة قد فتحت نافذة لمعرفة هيكل من أي وقت مضى أكثر تفصيلاً من الظواهر الخلوية، على طول الطريق وصولاً إلى المستوى الجزيئي. أساليب مثل التعمير البصرية العشوائية مجهرية (العاصفة)1،2،3، تنشيط صور التعريب مجهرية (النخيل)4،،من56،7 ومنظم الإضاءة مجهرية (SIM)8،،من910،11، وحفز الانبعاثات استنفاد مجهرية (STED)12،13، 14 قد تجاوزت الآن الحد حيود لتقديم التفاصيل لم يسبق لها مثيل في هيكل ووظيفة الخلايا الحية. ومع ذلك، كامل فهم كيف أن هذه النظم تتصرف يتطلب المعلومات الحيوية، فضلا عن المعلومات الهيكلية. القرار فائقة الأساليب المذكورة أعلاه تشمل مفاضلة بين القرار المكانية والأزمنة، يحد من الدقة الزمنية التي يمكن بحث العمليات الحيوية. أسلوب الذي يوفر عالية الدقة المكانية والزمانية القرار هو RT-3D-SPT15،،من1617،،من1819،20، 21،23،22،،من2426،25،27،،من2829. هنا، يمكننا التمييز بين SPT 3D التقليدية30 و RT-3D-SPT. التقليدية يتطلب 3D SPT ببساطة سلسلة زمنية من بيانات الصورة ثلاثية الأبعاد (والتي يمكن الحصول عليها أما باستخدام مجهر [كنفوكل] أو مجهر ابيفلوريسسينسي ونظرا للتكوين الصحيح). في 3D التقليدية-SPT، تتحدد إحداثيات الجسيمات بعد جمع البيانات بتحديد الجسيمات في كل مكدس الصورة وسلسلة المواقع الموجودة في وحدات التخزين المتعاقبة لإنشاء مسار. لهذه الأساليب، يتحدد القرار الزمانية في نهاية المطاف بمعدل التصوير الحجمي. لمجاهر [كنفوكل]، وهذا بسهولة بمقياس ثانية لعشرات ثواني. لأساليب ابيفلوريسسينسي، حيث يتم معالجته المسار البصري حيث أنه يمكن استخراج معلومات الموقع المحوري، يقتصر القرار الزماني وقت التعرض أو قراءات الكاميرا. تقتصر هذه الأساليب ابيفلوريسسينت في النطاق الذي يمكن جمع المعلومات المحوري، وعلى الرغم من التقدم الذي أحرز مؤخرا في مرحلة الطائرة فورييه أقنعة التصميم والبصريات التكيفية وتوسع هذه النطاقات إلى 10 ميكرون أو أكثر31،32 , 33 , 34.
وفي المقابل، RT-3D-SPT لا تعتمد على الحصول عليها كومة صور الثلاثية الأبعاد والجسيمات بعد وقوعها. بدلاً من ذلك، يتم استخراج معلومات الموقع في الوقت الحقيقي عن طريق الكشف عن نقطة واحدة وردود الفعل يطبق على فعالية "قفل" الجسيمات في تنسيق حجم العدسة الهدف عن طريق استخدام مرحلة كهرضغطية العالية السرعة. يسمح هذا القياس المستمر للموقف الجسيمات محدودة فقط التي يمكن جمعها كم عدد الفوتونات. وعلاوة على ذلك، تتيح هذه الطريقة الاستجواب الطيفية للجسيمات وهي تنتقل عبر مسافات بعيدة. RT-3D-SPT سارية المفعول قوي يعمل أقرب إلى فخ خالية من القوة ضوئية لكائنات النانو، حيث الجسيمات باستمرار سبر ويقاس في الوقت الحقيقي دون الحاجة إلى صلاحيات كبيرة الليزر أو البصرية. نظراً لأن RT-3D-SPT يوفر وسيلة للاستجواب مستمر من كائنات سريعة انتشارية (تصل إلى 20 ميكرون2/ق)25،29 في الأبعاد الثلاثة في فوتون المنخفضة عد أسعار20،29، 35، ينبغي أن يوفر نافذة في العمليات البيولوجية سريعة أو عابرة مثل نقل البضائع داخل الخلايا ويجند مستقبلات ملزم وديناميات فيريونس واحد خارج الخلية. ومع ذلك، إلى هذه النقطة، تطبيق RT-3D-SPT اقتصر على حفنة الجماعات التي تعمل على النهوض بهذه التكنولوجيا.
جدار واحد من تعقيد التخطيط البصرية المطلوبة بأساليب RT-3D-SPT، التي تتنوع. لمعظم طرق التغذية المرتدة البصرية يتم توفيرها من قبل مرحلة كهرضغطية. كالجسيمات يجعل الحركات الصغيرة في X، Y، أو Z، قراءات من نقطة واحدة للكشف عن تحويلها إلى وظائف خطأ وتغذية في عالي السرعة إلى نانوبوسيتيونير كهرضغطية، الذي بدوره ينتقل العينة للتصدي للحركة للجسيمات، وفعالية قفل عليه في مكان بالنسبة للعدسة الهدف. لقياس الحركات الموضعية الصغيرة في X، Y، و Z، أما متعددة (4 أو 5 اعتماداً على التنفيذ) للكشف عن15،،من1821 أو متعددة الإثارة البقع (2-4، الأقل من التي يمكن تطبيقها إذا يتم استخدام قفل في مكبر للصوت لاستخراج X وموقف Y باستخدام التناوب ليزر بقعة) تطبق25،28 . التداخل بين هذه البقع الكشف والانبعاث متعددة تجعل النظم صعوبة في محاذاة والحفاظ على.
هنا، نحن نقدم أسلوب عالي السرعة المستهدفة غير الساحلية و 3D-SPT مع تصميم بصرية مبسط يسمى 3D-ديبلوت29. يستخدم 3D-ديبلوت 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة وعلامة عدسة36،،من3738 للتحرك بشكل حيوي بقعة ليزر مركزة من خلال حجم التنسيق الموضوعي بمعدل مرتفع (50 كيلوهرتز XY، 70 كيلو هرتز Z). الجمع بين موضع تركيز الليزر ووقت وصول فوتون تمكن موقف 3D للجسيمات سرعة الحصول عليها حتى في معدلات العد فوتون منخفضة. 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة محركات تركيز الليزر في فارس جولة نمط39 مع حجم مربع من 1 x 1 ميكرومتر في الطائرة X-Y وعدسة العلامة ينتقل تركيز الليزر في اتجاه محوري مع مجموعة من 2-4 ميكرون. يتم الحصول على موقف 3D الجسيمات مع موضع أمثل تقدير خوارزمية29،40 في 3D. وتجري السيطرة 3D تتحرك بشكل حيوي ليزر بقعة، فوتون عد من الانهيار الضوئي (APD) وحساب موضع الجسيمات في الوقت الحقيقي، والمرحلة كهرضغطية التغذية المرتدة، وتسجيل البيانات في صفيف حقل بوابة القابلة لبرمجة (FPGA).في هذا البروتوكول، ونحن تصف كيفية بناء مجهر 3D-ديبلوت خطوة بخطوة، بما في ذلك محاذاة البصري، المعايرة مع جزيئات ثابتة، وأخيراً مجانية تتبع الجسيمات. كدليل، تم تعقبها الخرز الفلورسنت 110 في شمال البحر الأبيض المتوسط بشكل مستمر في الماء لمدة دقيقة في كل مرة.
الأسلوب الموصوفة هنا اختيار مثالي لأي تطبيق حيث أنه المطلوب لترصد باستمرار تحقيق فلورسنت تتحرك بسرعة في ضوء المستويات المنخفضة، بما في ذلك الفيروسات والجسيمات النانوية وحويصلات مثل اندوسوميس. وعلى النقيض من الأساليب السابقة، هناك فقط الإثارة واحد ومسار كشف واحد، جعل المحاذاة والصيانة مباشرة. وعلاوة على ذلك، يتيح مجال كبير في الكشف عن هذا المجهر لالتقاط بسهولة بسرعة نزع فتيل الجسيمات، بينما القدرة على تتبع المستويات إشارة منخفضة (وصولاً إلى 10 كيلوهرتز) يجعل هذا الأسلوب المثالي لتطبيقات الإضاءة المنخفضة29.

<table><tbody><tr><td>2D العاكس الكهروضوئي &nbsp;</td><td>ConOptics</td><td>M310A</td><td>2 المطلوب</td></tr><tr><td>مصدر الطاقة ل EOD</td><td>ConOptics</td><td>412</td><td>يحول إخراج FPGA إلى جهد عالي ل EOD</td></tr><tr><td>TAG &nbsp ؛ عدسة</td><td>TAG بصريات</td><td>TAG 2.0</td><td>تستخدم لتحويل الليزر على طول الاتجاه المحوري</td></tr><tr><td>XY جهاز تحديد المواقع النانوية الكهرضغطية</td><td>MadCity Labs</td><td>Nano-PDQ275HS</td><td>تستخدم لتحريك العينة لقفل الجسيم في الحجم البؤري الموضوعي في & nbsp ؛</td></tr><tr><td>Z النانو الكهرضغطية</td><td>MadCity Labs</td><td>Nano-OP65HS</td><td>تستخدم لتحريك العدسة الموضوعية لمتابعة منتشرة الجسيمات</td></tr><tr><td>المصغر</td><td>MadCity Labs</td><td>MicroDrive</td><td>تستخدم لوضع العينة بشكل خشن وتقييم</td></tr><tr><td>العدسة الموضوعية</td><td>Zeiss</td><td>PlanApo</td> فتحة <td>عددية عالية مطلوبة للحصول على أفضل حساسية. 100X ، 1.49 NA ، M27 ، كاميرا Zeiss</td></tr><tr><td>sCMOS</td><td>PCO</td><td>pco.edge 4.2</td><td>تستخدم لمراقبة موضع الجسيم</td></tr><tr><td>APD</td><td>Excelitas</td><td>SPCM-ARQH-15</td><td>التهم المظلمة السفلية مفيدة</td></tr><tr><td>مصفوفة البوابة القابلة للبرمجة الميدانية</td><td>الأدوات الوطنية</td><td>NI-7852r</td><td></td></tr><tr><td>البرمجيات</td><td>مختبر الأدوات</td><td>الوطنيةعرض</td><td></td></tr> تتبع <tr><td>الإثارة ليزر</td><td>JDSU</td><td>FCD488-30</td><td></td></tr><tr><td>عدسة</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>L1</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L2</td></tr><tr><td>Pinhole</td><td>ThorLabs</td><td>P75S</td><td>PH</td></tr><tr><td>Glan-Thompson Polarizer</td><td>ThorLabs</td><td>GTH5-A</td><td>GT</td></tr><tr><td>لوحة نصف الموجة</td><td>ThorLabs</td><td>WPH05M-488</td><td>WP</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-75-A-ML</td><td>L3</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-250-A-ML</td><td>L4</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L5</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L6</td></tr><tr><td>مرآة ثنائية اللون</td><td>Chroma</td><td>ZT405 / 488/561 / 640rpc</td><td>DC</td></tr><tr><td>مرشح انبعاث مضان</td><td>Chroma</td><td>D535 / 40m</td><td>F</td></tr><tr><td>10/90 beamsplitter</td><td>Chroma</td><td>21012</td><td>BS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>190 نانومتر الجسيمات النانوية الفلورية</td><td>مختبرات الانفجارات</td><td>FC02F / 9942</td><td></td></tr><tr><td>110 نانومتر الجسيمات النانوية الفلورية</td><td>مختبرات الانفجارات</td><td>FC02F / 10617</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545A</td><td></td></tr><tr><td>Powermeter</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>CMOS</td><td>Thorlabs</td><td>DCC1545M</td><td></td></tr><tr><td>Iris</td><td>Thorlabs</td><td>SM1D12D</td><td></td></tr><tr><td>المجهر</td> Mad <td>City Labs</td><td>RM21</td><td></td></tr></tbody></table>

بروتوكول لتتبع في الوقت الحقيقي 3d الجسيمات مفردة

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

جسيم واحد ثلاثي الأبعاد في الوقت الحقيقي تتبع (RT-3D-SPT) لديه القدرة على إلقاء الضوء على عمليات سريعة، 3D في أنظمة الهاتف الخلوي. على الرغم من أن أساليب RT-3D-SPT مختلفة قدمت في السنوات الأخيرة، تتبع عالية السرعة 3D نزع فتيل الجسيمات في معدلات العد فوتون منخفضة لا يزال يمثل تحديا. وعلاوة على ذلك، الرايت-3D-SPT الأجهزة عادة ما تكون معقدة وصعبة التنفيذ، تحد من تطبيقها على نطاق واسع للمشاكل البيولوجية. ويعرض هذا البروتوكول نظام RT-3D-SPT المسمى 3D "دينامية فوتون التعريب تتبع" (3D-ديبلوت)، التي يمكن أن تتبع الجسيمات بسرعة انتشارية عالية (تصل إلى 20 ميكرون/ق2) أسعار العد فوتون منخفضة (وصولاً إلى 10 كيلوهرتز). يستخدم 3D-ديبلوت منحرف الكهرضوئية ثنائية الأبعاد (2D--التخلص من الذخائر المتفجرة) وعدسة الانضباطي تدرج صوتي (علامة) إلى محرك أقراص واحد وركزت الليزر المستطيل بشكل حيوي في 3D. 3D-ديبلوت جنبا إلى جنب مع خوارزمية تقدير موقف أمثل، يمكن أن تلتحم جزيئات مفردة مع تعقب عالية السرعة والدقة العالية ومسلم. نظراً للإثارة واحدة وتخطيط مسار كشف واحد، 3D-ديبلوت قوية وسهلة لإقامة. ويناقش هذا البروتوكول كيفية بناء 3D-ديبلوت خطوة بخطوة. أولاً، يتم وصف تخطيط البصرية. المقبل، هو النظام معايرة والأمثل من قبل النقطية المسح حبة فلورسنت 190 نيوتن متر مع نانوبوسيتيونير كهرضغطية. أخيرا، وللتدليل على تتبع قدرة 3D في الوقت الحقيقي، يتم تعقب الخرز الفلورسنت 110 في شمال البحر الأبيض المتوسط في المياه.

الجسيمات الثابتة المسح الضوئي (الشكل 4) ونشرها بحرية 110 نانومتر الفلورسنت الجسيمات تتبع (الشكل 5) أجريت في أعقاب البروتوكول أعلاه. وأجرى المسح الجسيمات بتحريك الفوتونات نانوبوسيتيونير وبن كهرضغطية بينما في نفس الوقت حساب الجسيمات يقدر الموقف عند كل نقطة في المسح الضوئي. مسح الصورة يظهر مربع من كثافة حتى (الشكل 4a) والمواقف المقدرة التي تظهر علاقة خطية مع الموقف الحقيقي للجسيمات أكثر من 1 × 1 × 2 ميك...

تفاصيل البروتوكول هذا ببناء وتشغيل المجهر تتبع في الوقت الحقيقي 3D الجسيمات واحدة قادرة على تعقب النانو الفلورسنت يسبر سرعة انتشارية عالية ومعدلات العد فوتون منخفضة.

بروتوكول لتتبع في الوقت الحقيقي 3D الجسيمات مفردة

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تنفيذ مجهر تتبع جسيمات واحدة ثلاثي الأبعاد في الوقت الفعلي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن مراقبة جسم واحد منتشر على مقياس النانو بشكل مستمر بدقة زمنية محدودة الفوتون. يمكن أن تساعد هذه التقنية في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الفيروسات ، مثل اتباع فيريون واحد خلال عملية العدوى بأكملها.تحضير الجهاز على طاولة بصرية. هذا الإعداد جاهز للمعايرة. تشمل المكونات الرئيسية ليزر الحالة الصلبة 488 نانومتر ، وعاكسين كهروضوئيين على طول مسار الشعاع ، وعدسة تدرج صوتي قابلة للضبط ، ومرحلة عينة مع محددات تحديد المواقع الدقيقة والنانوية.يوفر هذا التخطيطي للإعداد تفاصيل إضافية. هنا مسار شعاع الليزر إلى مرحلة العينة. توجد العواكس الكهروضوئية والعدسة الصوتية القابلة للضبط على طول مسار الحزمة.تقوم هذه الأجهزة بتشغيل بقعة الليزر ديناميكيا في مرحلة العينة. يتم حساب الفوتونات من العينة بواسطة الصمام الثنائي لصور الانهيار الجليدي. تراقب الكاميرا موضع الجسيم.يتم تعيين موضع العينة باستخدام وحدات التحكم الدقيقة والنانوية. تتحكم مصفوفة البوابة القابلة للبرمجة الميدانية في بقعة الليزر ، وحساب موضع الجسيمات في الوقت الفعلي ، وردود فعل المرحلة ، وعد الفوتونات. يجب تحضير عينتين.الأول ، يتطلب حبات فلورية 190 نانومتر مخففة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات. استخدم زلة غطاء لتحضير عينة جسيمات ثابتة. ضع 400 ميكرولتر من محلول الخرزة على زلة الغطاء.الآن ، قم بإنتاج عينة الجسيمات المتحركة الحرة. يتطلب حبات فلورسنت 110 نانومتر مخففة في الماء. قم بإنشاء عينة جسيمات متحركة حرة عن طريق وضع 400 ميكرولتر من المحلول على زلة غطاء.خذ عينة الجسيمات الثابتة إلى المجهر لتركيبها. العينة موجودة على محدد موضع XY nano. قم بتشغيل الليزر وكاشف الصور ووحدات التحكم لعناصر خط الشعاع وأجهزة تحديد المواقع.قم بتشغيل محدد موضع Piezo nano في حلقة مغلقة. بعد ذلك ، قم بإزالة مرشح انبعاث التألق من أمام كاشف الصور. بعد ذلك، قم بتغيير موضع العينة على شكل z باستخدام محدد الموضع الصغير.مع اختلاف الموضع ، استخدم كاشف الصور لمراقبة شدة انعكاس الليزر. تعظيم الكثافة لتحديد المستوى البؤري للعدسة الشيئية. مع وجود العينة في المستوى البؤري ، استبدل مرشح انبعاث التألق.الآن ، اعمل مع برنامج التحكم في الكمبيوتر. استخدم برنامجا مخصصا لمسح العينة ضوئيا نقطيا. أولا ، قم بتعيين نطاق مسح كبير ، الفرق بين البداية والنهاية.هنا ، النطاق هو 10 ميكرومتر في Y و 10 ميكرومتر في X.أيضا ، قم بتعيين حجم خطوة كبير في كل اتجاه. هنا ، 200 نانومتر. قم بتعيين كلا حقلي Z على الموضع المحدد مسبقا للمستوى البؤري.سيؤدي الفحص الفوري إلى بدء الفحص النقطي. ابدأ الفحص. يقوم البرنامج بتشغيل العاكسات الكهروضوئية في جولة ليلية ، ويجمع التهم من كاشف الصور ، ويقود محدد موضع النانو ، ويقوم بإجراء حسابات الموضع.سيجد الفحص جسيما يمكن التعرف عليه في البرنامج من خلال مضان بلاتا. لكل موقع في الفحص ، سيحدد البرنامج أيضا تقديرات لموضع الجسيمات في X و Y ، بالنسبة لمركز مسح عاكس الجسم الكهربائي. بعد العثور على الجسيم ، قم بتقليص نطاق المسح المحيط به إلى ميكرومترين في X و Y ، كما قلل حجم الخطوة لكليهما إلى 100 نانومتر.أضف نطاق مسح ضوئي في الاتجاه Z لميكرومترين لوضع تركيز الفلورسنت. اضبط حجم خطوة Z على 200 نانومتر. ابدأ المسح النقطي ثلاثي الأبعاد للعثور على تركيز الفلورسنت.تظهر البيانات الناتجة عن الفحص المستوى البؤري قبل تشغيل عدسة التدرج الصوتي القابلة للضبط. انتقل إلى العمل مع إعداد العدسة الصوتية القابلة للضبط داخل برنامج التحكم الخاص به. أولا ، انقر فوق اتصال ، ثم تشغيل.انتقل إلى قسم التحكم في النبض والبوابات ، وقم بتغيير وضع مشغل الإخراج من RGB إلى متعدد المستويات. ثم قم بتغييره مرة أخرى إلى RGB للسماح بتغيير مرحلة الإخراج. استخدم أشرطة التمرير لضبط مرحلة الإخراج بين صفر درجة و 90 درجة و 270 درجة.بعد ذلك ، انتقل إلى قسم التحكم في التردد. هناك ، حدد تردد رنين 68 ، 500 هرتز. انتقل إلى أعلى الشاشة وانقر فوق خيارات متقدمة.ثم اختر علامة تبويب الإعدادات. على الشاشة الجديدة ، ابحث عن الحد الأقصى لتكرار عمود الصفر. اضبطه لتغيير نطاق البحث عن التردد.انقر ، احفظ المعايرة ، ثم اخرج من المعايرة. العودة إلى عناصر التحكم في التردد وتغيير تردد الرنين. قم بتغييره على الفور مرة أخرى إلى 68،500 هرتز لتصبح المعايرة سارية المفعول.في قسم التحكم في السعة ، استخدم شريط التمرير لرفع السعة ببطء إلى 35٪ بعد ذلك ، انقر فوق رنين القفل. عندما يكون التردد مقفلا، انقر فوق إلغاء قفل الرنين. ارجع إلى برنامج المسح الضوئي للبيانات النقطية.أدخل نطاقين للمسح الضوئي ميكرومتر متمركزين على الجسيم في X و Y.استخدم حجم خطوة يبلغ 100 نانومتر. توسيط الجسيم في نطاق أربعة ميكرومترات في Z ، بحجم خطوة 200 نانومتر. في صورة المسح التي تنتج ، يبلغ عرض منطقة الإضاءة التي تمثل الجسيم حوالي ميكرومتر واحد.بناء على ذلك ، اضبط معلمة مقياس XY بحيث تتراوح المواضع المقدرة في X و Y من سالب 0.5 إلى 0.5 ميكرومتر. بعد إجراء مماثل باستخدام مقياس Z ، اضبط محدد موضع النانو على وضع الصفر. قم بإيقاف تشغيل جهاز تحديد موضع النانو قبل المتابعة.استبدل عينة الجسيمات الثابتة بعينة الجسيمات المتحركة بحرية. بعد ذلك ، تأكد من تشغيل جميع المعدات. قم بتشغيل محدد موضع Piezo nano في حلقة مفتوحة.في الكمبيوتر، اضبط برنامج عدسة التدرج الصوتي القابل للضبط كما كان من قبل. قم بإزالة مرشح انبعاث التألق من المسار إلى كاشف الصور. أوجد المستوى البؤري عن طريق تغيير موضع العينة Z وزيادة شدة انعكاس الليزر إلى أقصى حد من زلة الغطاء.بعد العثور على المستوى البؤري ، قم بزيادة موضع التركيز 15 ميكرومتر في المحلول. استبدل مرشح الانبعاث الفلوري. افتح برنامج التتبع المخصص.قم بتعيين معلمات تقدير الموضع إلى القيم التي تم العثور عليها أثناء التحسين. الآن ، قم بتعيين ثوابت التحكم المتكاملة ، والتي تملي سرعة استجابة محدد موضع النانو. ابدأ بثابت X.أدخل قيمة منخفضة وزدها ببطء. عندما تبدأ التذبذبات في قراءة موضع الجسيمات ، لاحظ قيمة ثابت التحكم. تقليل ثابت التحكم المتكامل إلى حوالي 70٪ من قيمته في بداية التذبذب.كرر الخطوات باستخدام ثوابت التحكم Y و Z. اضبط الزناد لبدء تتبع عتبة المسار على ثلاثة كيلو هرتز. قم بتعيين الحد الأدنى للمسار ، الزناد لإنهاء التتبع ، عند 1.5 كيلو هرتز.ابدأ التجربة بالنقر فوق بحث ثم النقر على التتبع التلقائي. يوضح هذا الفيلم نتيجة استخدام مجهر تتبع توطين الفوتون الديناميكي ثلاثي الأبعاد لتتبع الحركة المنتشرة لجسيم نانو فلوري 110 نانومتر في الماء. يظهر موضع الجسيم ، الذي تم قياسه باستخدام قراءة موضع محدد موضع النانو على المحاور ثلاثية الأبعاد.الجزء الداخلي هو قراءة كاميرا طحلب البحر العلمية. يوضح أن الجسيم يتم تثبيته ، مغلقا في الحجم البؤري ، بواسطة نظام التتبع. تم تتبع الجسيم وتسجيل موقعه لأكثر من دقيقتين.بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في أقل من 50 دقيقة ، إذا تمت محاذاة النظام بشكل صحيح ، وتم تعيين معلمات المعايرة. بعد تطويرها ، ستساعد هذه التقنية الباحثين في مجال توصيل الأدوية على استكشاف مسارات استيعاب ونقل البضائع الخلوية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تشغيل مجهر تتبع الجسيمات المفردة ثلاثية الأبعاد.

a-protocol-for-real-time-3d-single-particle-tracking

Research

JoVE Journal

Bioengineering

الهندسة الحيوية

يصف هذا البروتوكول كيفية استخدام الفحص المجهري الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي لتصور وتتبع المستقبلات المفردة على سطح الخلايا الحية وبالتالي تحليل الحركة الجانبية للمستقبلات وحجم مجمعات المستقبلات وكذلك لتصور تفاعلات المستقبلات العابرة. يمكن تمديد هذا البروتوكول ليشمل بروتينات الغشاء الأخرى.

عالية الدقة تحليل الزمانية المكانية من مستقبلات حيوية من قبل جزيء واحدة الإسفار الميكروسكوب

في بروتوكول الفيديو هذا ، نتتبع - بسرعة عالية وبثلاثة أبعاد - الجسيمات الحالة المصنفة بالفلورسنت داخل الخلايا الحية ، باستخدام طريقة التتبع المداري في مجهر ثنائي الفوتون المعدل.

3D تتبع المداري في التعديل المجهر ثنائي الفوتون: دراسة تطبيقية على تتبع من بين الخلايا الحويصلات

ووصف ثلاثي الأبعاد تتبع الجسيمات السرعة بواسطة (3D-PTV) نظام يقوم على كاميرا عالية السرعة مع الخائن أربعة الرأي هنا. يتم تطبيق هذه التقنية لتدفق طائرة من أنبوب دائري في محيط عشرة أقطار المصب في عدد رينولدز إعادة ≈ 7000.

ثلاثي الأبعاد السرعة بواسطة الجسيمات تتبع للتطبيقات الاضطراب: حالة من تدفق جت

يتم تقديم طريقة لإعداد غرويات Janus النشطة تحفيزيا والتي يمكنها "السباحة" في السوائل وتحديد مساراتها ثلاثية الأبعاد.

تتبع إعداد و3D من التحفيز أجهزة سباحة

تعرض المخطوطة بروتوكولا لإجراء تجارب نقل الرواسب ذات الأحمال السرير حيث يتم تتبع الجسيمات المتحركة بتحليل الصور. ويقدم المرفق التجريبي، وإجراءات إدراك التشغيل ومعالجة البيانات، وأخيرا بعض نتائج إثبات المفهوم.

تتبع الجسيمات لاغرانجي القائم على الصورة في التجارب السرير تحميل

نقدم هنا، بروتوكولا للجسيمات واحدة تتبع تحليل الصور التي تتيح التقييم الكمي لنشر معاملات، أنواع الحركة والكتلة أحجام الجسيمات واحد الكشف عنها بواسطة الفحص المجهري الأسفار.

معالجة البروتوكول لتحليل نشر وحجم الكتلة من مستقبلات الغشاء بالفحص المجهري Fluorescence الصور

الهدف من هذا البروتوكول هو استخدام درجه الحرارة للسيطرة علي سرعات تدفق السوائل النشطة ثلاثية الابعاد. ميزه هذا الأسلوب لا يسمح فقط لتنظيم سرعات التدفق في الموقع ولكن أيضا تمكن التحكم الديناميكي ، مثل بشكل دوري ضبط سرعات التدفق صعودا وهبوطا.

التحكم في سرعات تدفق السوائل النشطة ثلاثية الابعاد المستندة إلى Microtubule باستخدام درجه الحرارة

يصف هذا البروتوكول نهج معالجة الصور القائم على iSCAT وتتبع الجسيمات المفردة الذي يتيح التحقيق المتزامن للكتلة الجزيئية والسلوك المنتشر للجزيئات الكبيرة التي تتفاعل مع الأغشية الدهنية. يتم توفير إرشادات خطوة بخطوة لإعداد العينات، والتحويل من الكتلة إلى التباين، والحصول على الأفلام، وما بعد المعالجة جنبا إلى جنب مع الاتجاهات لمنع المزالق المحتملة.

تتبع الجسيمات الحساسة للكتلة لتوصيف ديناميكيات الجزيئات الكبيرة المرتبطة بالغشاء

لقد ثبت أن العديد من البروتينات المضطربة جوهريا تشارك في تكوين المكثفات الجزيئية الحيوية الديناميكية للغاية ، وهو سلوك مهم للعديد من العمليات الخلوية. هنا ، نقدم طريقة قائمة على التصوير أحادي الجزيء لتحديد الديناميات التي تتفاعل بها البروتينات مع بعضها البعض في المكثفات الجزيئية الحيوية في الخلايا الحية.

قياس جزيء واحد لديناميكيات تفاعل البروتين داخل المكثفات الجزيئية الحيوية

تقدم هذه المقالة وصفا مفصلا لكيفية إنشاء عينات لتتبع البروتين الواحد في طبقات الدهون الثنائية المدعومة بالمواد الصلبة. كما يشرح المجهر الفلوري البسيط بحساسية جزيء واحد ومعدل إطارات سريع. وأخيرا، نستعرض الإجراء لاستخراج مسارات البروتين الواحد.

تتبع البروتينات المفردة في طبقات الدهون الثنائية باستخدام المجهر الفلوري

اكتشف بروتوكول تتبع الجسيمات المفردة ثلاثية الأبعاد في الوقت الحقيقي باستخدام المجهر الضوئي المتقدم. تتيح هذه التقنية مراقبة الجسيمات النانوية الفلورية والفيروسات الفردية باستمرار حتى في ظروف الإضاءة المنخفضة.

بروتوكول لتتبع في الوقت الحقيقي 3D الجسيمات مفردة

استكشف المزيد من الفيديوهات