بروتوكول لتتبع في الوقت الحقيقي 3D الجسيمات مفردة
January 3rd, 2018
تفاصيل البروتوكول هذا ببناء وتشغيل المجهر تتبع في الوقت الحقيقي 3D الجسيمات واحدة قادرة على تعقب النانو الفلورسنت يسبر سرعة انتشارية عالية ومعدلات العد فوتون منخفضة.
الهدف العام من هذا البروتوكول هو تنفيذ مجهر تتبع جسيمات واحدة ثلاثي الأبعاد في الوقت الفعلي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن مراقبة جسم واحد منتشر على مقياس النانو بشكل مستمر بدقة زمنية محدودة الفوتون. يمكن أن تساعد هذه التقنية في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الفيروسات ، مثل اتباع فيريون واحد خلال عملية العدوى بأكملها.
تحضير الجهاز على طاولة بصرية. هذا الإعداد جاهز للمعايرة. تشمل المكونات الرئيسية ليزر الحالة الصلبة 488 نانومتر ، وعاكسين كهروضوئيين على طول مسار الشعاع ، وعدسة تدرج صوتي قابلة للضبط ، ومرحلة عينة مع محددات تحديد المواقع الدقيقة والنانوية.
يوفر هذا التخطيطي للإعداد تفاصيل إضافية. هنا مسار شعاع الليزر إلى مرحلة العينة. توجد العواكس الكهروضوئية والعدسة الصوتية القابلة للضبط على طول مسار الحزمة.
تقوم هذه الأجهزة بتشغيل بقعة الليزر ديناميكيا في مرحلة العينة. يتم حساب الفوتونات من العينة بواسطة الصمام الثنائي لصور الانهيار الجليدي. تراقب الكاميرا موضع الجسيم.
يتم تعيين موضع العينة باستخدام وحدات التحكم الدقيقة والنانوية. تتحكم مصفوفة البوابة القابلة للبرمجة الميدانية في بقعة الليزر ، وحساب موضع الجسيمات في الوقت الفعلي ، وردود فعل المرحلة ، وعد الفوتونات. يجب تحضير عينتين.
الأول ، يتطلب حبات فلورية 190 نانومتر مخففة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات. استخدم زلة غطاء لتحضير عينة جسيمات ثابتة. ضع 400 ميكرولتر من محلول الخرزة على زلة الغطاء.
الآن ، قم بإنتاج عينة الجسيمات المتحركة الحرة. يتطلب حبات فلورسنت 110 نانومتر مخففة في الماء. قم بإنشاء عينة جسيمات متحركة حرة عن طريق وضع 400 ميكرولتر من المحلول على زلة غطاء.
خذ عينة الجسيمات الثابتة إلى المجهر لتركيبها. العينة موجودة على محدد موضع XY nano. قم بتشغيل الليزر وكاشف الصور ووحدات التحكم لعناصر خط الشعاع وأجهزة تحديد المواقع.
قم بتشغيل محدد موضع Piezo nano في حلقة مغلقة. بعد ذلك ، قم بإزالة مرشح انبعاث التألق من أمام كاشف الصور. بعد ذلك، قم بتغيير موضع العينة على شكل z باستخدام محدد الموضع الصغير.
مع اختلاف الموضع ، استخدم كاشف الصور لمراقبة شدة انعكاس الليزر. تعظيم الكثافة لتحديد المستوى البؤري للعدسة الشيئية. مع وجود العينة في المستوى البؤري ، استبدل مرشح انبعاث التألق.
الآن ، اعمل مع برنامج التحكم في الكمبيوتر. استخدم برنامجا مخصصا لمسح العينة ضوئيا نقطيا. أولا ، قم بتعيين نطاق مسح كبير ، الفرق بين البداية والنهاية.
هنا ، النطاق هو 10 ميكرومتر في Y و 10 ميكرومتر في X.أيضا ، قم بتعيين حجم خطوة كبير في كل اتجاه. هنا ، 200 نانومتر. قم بتعيين كلا حقلي Z على الموضع المحدد مسبقا للمستوى البؤري.
سيؤدي الفحص الفوري إلى بدء الفحص النقطي. ابدأ الفحص. يقوم البرنامج بتشغيل العاكسات الكهروضوئية في جولة ليلية ، ويجمع التهم من كاشف الصور ، ويقود محدد موضع النانو ، ويقوم بإجراء حسابات الموضع.
سيجد الفحص جسيما يمكن التعرف عليه في البرنامج من خلال مضان بلاتا. لكل موقع في الفحص ، سيحدد البرنامج أيضا تقديرات لموضع الجسيمات في X و Y ، بالنسبة لمركز مسح عاكس الجسم الكهربائي. بعد العثور على الجسيم ، قم بتقليص نطاق المسح المحيط به إلى ميكرومترين في X و Y ، كما قلل حجم الخطوة لكليهما إلى 100 نانومتر.
أضف نطاق مسح ضوئي في الاتجاه Z لميكرومترين لوضع تركيز الفلورسنت. اضبط حجم خطوة Z على 200 نانومتر. ابدأ المسح النقطي ثلاثي الأبعاد للعثور على تركيز الفلورسنت.
تظهر البيانات الناتجة عن الفحص المستوى البؤري قبل تشغيل عدسة التدرج الصوتي القابلة للضبط. انتقل إلى العمل مع إعداد العدسة الصوتية القابلة للضبط داخل برنامج التحكم الخاص به. أولا ، انقر فوق اتصال ، ثم تشغيل.
انتقل إلى قسم التحكم في النبض والبوابات ، وقم بتغيير وضع مشغل الإخراج من RGB إلى متعدد المستويات. ثم قم بتغييره مرة أخرى إلى RGB للسماح بتغيير مرحلة الإخراج. استخدم أشرطة التمرير لضبط مرحلة الإخراج بين صفر درجة و 90 درجة و 270 درجة.
بعد ذلك ، انتقل إلى قسم التحكم في التردد. هناك ، حدد تردد رنين 68 ، 500 هرتز. انتقل إلى أعلى الشاشة وانقر فوق خيارات متقدمة.
ثم اختر علامة تبويب الإعدادات. على الشاشة الجديدة ، ابحث عن الحد الأقصى لتكرار عمود الصفر. اضبطه لتغيير نطاق البحث عن التردد.
انقر ، احفظ المعايرة ، ثم اخرج من المعايرة. العودة إلى عناصر التحكم في التردد وتغيير تردد الرنين. قم بتغييره على الفور مرة أخرى إلى 68،500 هرتز لتصبح المعايرة سارية المفعول.
في قسم التحكم في السعة ، استخدم شريط التمرير لرفع السعة ببطء إلى 35٪ بعد ذلك ، انقر فوق رنين القفل. عندما يكون التردد مقفلا، انقر فوق إلغاء قفل الرنين. ارجع إلى برنامج المسح الضوئي للبيانات النقطية.
أدخل نطاقين للمسح الضوئي ميكرومتر متمركزين على الجسيم في X و Y.استخدم حجم خطوة يبلغ 100 نانومتر. توسيط الجسيم في نطاق أربعة ميكرومترات في Z ، بحجم خطوة 200 نانومتر. في صورة المسح التي تنتج ، يبلغ عرض منطقة الإضاءة التي تمثل الجسيم حوالي ميكرومتر واحد.
بناء على ذلك ، اضبط معلمة مقياس XY بحيث تتراوح المواضع المقدرة في X و Y من سالب 0.5 إلى 0.5 ميكرومتر. بعد إجراء مماثل باستخدام مقياس Z ، اضبط محدد موضع النانو على وضع الصفر. قم بإيقاف تشغيل جهاز تحديد موضع النانو قبل المتابعة.
استبدل عينة الجسيمات الثابتة بعينة الجسيمات المتحركة بحرية. بعد ذلك ، تأكد من تشغيل جميع المعدات. قم بتشغيل محدد موضع Piezo nano في حلقة مفتوحة.
في الكمبيوتر، اضبط برنامج عدسة التدرج الصوتي القابل للضبط كما كان من قبل. قم بإزالة مرشح انبعاث التألق من المسار إلى كاشف الصور. أوجد المستوى البؤري عن طريق تغيير موضع العينة Z وزيادة شدة انعكاس الليزر إلى أقصى حد من زلة الغطاء.
بعد العثور على المستوى البؤري ، قم بزيادة موضع التركيز 15 ميكرومتر في المحلول. استبدل مرشح الانبعاث الفلوري. افتح برنامج التتبع المخصص.
قم بتعيين معلمات تقدير الموضع إلى القيم التي تم العثور عليها أثناء التحسين. الآن ، قم بتعيين ثوابت التحكم المتكاملة ، والتي تملي سرعة استجابة محدد موضع النانو. ابدأ بثابت X.
أدخل قيمة منخفضة وزدها ببطء. عندما تبدأ التذبذبات في قراءة موضع الجسيمات ، لاحظ قيمة ثابت التحكم. تقليل ثابت التحكم المتكامل إلى حوالي 70٪ من قيمته في بداية التذبذب.
كرر الخطوات باستخدام ثوابت التحكم Y و Z. اضبط الزناد لبدء تتبع عتبة المسار على ثلاثة كيلو هرتز. قم بتعيين الحد الأدنى للمسار ، الزناد لإنهاء التتبع ، عند 1.5 كيلو هرتز.
ابدأ التجربة بالنقر فوق بحث ثم النقر على التتبع التلقائي. يوضح هذا الفيلم نتيجة استخدام مجهر تتبع توطين الفوتون الديناميكي ثلاثي الأبعاد لتتبع الحركة المنتشرة لجسيم نانو فلوري 110 نانومتر في الماء. يظهر موضع الجسيم ، الذي تم قياسه باستخدام قراءة موضع محدد موضع النانو على المحاور ثلاثية الأبعاد.
الجزء الداخلي هو قراءة كاميرا طحلب البحر العلمية. يوضح أن الجسيم يتم تثبيته ، مغلقا في الحجم البؤري ، بواسطة نظام التتبع. تم تتبع الجسيم وتسجيل موقعه لأكثر من دقيقتين.
بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في أقل من 50 دقيقة ، إذا تمت محاذاة النظام بشكل صحيح ، وتم تعيين معلمات المعايرة. بعد تطويرها ، ستساعد هذه التقنية الباحثين في مجال توصيل الأدوية على استكشاف مسارات استيعاب ونقل البضائع الخلوية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تشغيل مجهر تتبع الجسيمات المفردة ثلاثية الأبعاد.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
يوضح هذا البروتوكول تنفيذ مجهر تتبع جسيم واحد ثلاثي الأبعاد في الوقت الحقيقي المصمم لمراقبة المستكشفات الفلورية على نطاق النانو. تسمح هذه التقنية بالمراقبة المستمرة للأجسام المفردة المنتشرة، حتى في ظروف محدودة الفوتونات.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- المجهر
- تتبع جسيم واحد
- علم الفيروسات
الخلفية
- التتبع في الوقت الحقيقي للجسيمات على نطاق النانو بالغ الأهمية في العديد من المجالات العلمية.
- فهم ديناميكيات الفيروسات المفردة يمكن أن يوفر رؤى حول عمليات العدوى.
- تعزز هذه التقنية القدرة على دراسة الجسيمات بسرعات انتشارية عالية.
- يتم معالجة قيود عدد الفوتونات من خلال الإعدادات الضوئية المتقدمة.
هدف الدراسة
- تطوير مجهر يمكنه تتبع الجسيمات المفردة في الوقت الحقيقي.
- تسهيل دراسة العدوى الفيروسية عن طريق مراقبة الفيروسات الفردية.
- تحسين الدقة الزمنية لتتبع الأجسام على نطاق النانو.
الطرق المستخدمة
- بناء مجهر تتبع جسيم واحد ثلاثي الأبعاد.
- استخدام ليزر الحالة الصلبة 488 نانومتر.
- دمج عواكس كهرو-ضوئية وعدسة تدرج صوتية قابلة للضبط.
- معايرة الجهاز على طاولة بصرية مع تحديد موضع دقيق.
النتائج الرئيسية
- نجح المجهر في تتبع المستكشفات الفلورية على نطاق النانو.
- ثبت القدرة على مراقبة الجسيمات بمعدلات منخفضة من عدد الفوتونات.
- مكن من المراقبة المستمرة للفيروسات المفردة أثناء العدوى.
- وفر رؤى حول ديناميكيات العمليات الفيروسية.
الاستنتاجات
- يؤسس هذا البروتوكول طريقة قوية لتتبع الجسيمات في الوقت الحقيقي.
- يفتح مسارات جديدة للبحث في علم الفيروسات والمجالات ذات الصلة.
- يمكن أن تعزز هذه التقنية بشكل كبير فهمنا لسلوك الفيروسات.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Real-time 3D single particle tracking enables continuous monitoring of nanoscale objects under photon-limited conditions, addressing a critical gap in observing fast, three-dimensional cellular processes. This capability supports mechanistic de-risking in early discovery by providing high-resolution dynamic data on molecular interactions and trafficking pathways. The method enhances predictive confidence in target validation and lead identification by delivering quantitative, reproducible spatiotemporal data essential for informed go/no-go decisions in drug delivery and virology research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracking single virions or nanoparticles through infection processes with high spatiotemporal resolution.
- Operational Value: Provides functional target validation through direct observation of molecular dynamics in near-native environments.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating quantitative data on particle diffusion, binding, and transport kinetics under physiologically relevant conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative dependent variable measurements (position, trajectory, diffusion coefficient) essential for assay standardization and hit confirmation.
- Operational Value: Enables preparation of validated biological systems for downstream screening via precise 3D localization and tracking of fluorescent probes.
- Scalability: Supports platform reuse through robust single-excitation/single-detection layout and calibrated electro-optic and acoustic gradient lens control.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by enabling real-time observation of cellular cargo internalization and transport pathways relevant to drug delivery.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in viral entry and intracellular trafficking models through direct visualization of single-particle behavior in solution.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by providing reproducible, high-fidelity data on nanoparticle behavior under low photon flux conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly for studies requiring dynamic, nanoscale resolution in three dimensions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling continuous tracking of single particles in 3D space under physiological mimicry.
- Screening: Enhances assay readiness through reproducible particle localization and tracking, facilitating reliable compound or nanoparticle evaluation.
- Analytics: Generates quantitative outputs (position, velocity, confinement) that allow objective comparison of experimental conditions and therapeutic candidates.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling drug delivery pathways and viral infection dynamics in biologically relevant systems.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability due to its modular optical layout, calibration protocol, and adaptability to different sample types and tracking objectives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in nanoscale biological processes.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through calibrated raster scanning, position estimation algorithms, and feedback-controlled nano-positioning.
- Strategic Value: Improves capital efficiency and reduces late-stage biological risk by enabling early, data-driven decisions on target druggability and delivery mechanism feasibility.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantitative, high-resolution tracking data that inform advancement criteria in drug delivery and antiviral development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical alignment, laser safety, and real-time control systems including FPGA-based feedback loops.
- Depends on specialized instrumentation: 488 nm solid-state laser, 2D electro-optic deflectors, tunable acoustic gradient lens, avalanche photodiode, and nano-positioning stages.
- Necessitates cross-team standardization for calibration protocols, position estimation parameters, and integral control constant tuning across users and labs.
- Involves adaptation considerations when transitioning from fixed bead samples to freely moving particles in viscous or complex biological media.
- Practical limitations include sensitivity to photon count rates and the need for careful optimization of tracking thresholds (e.g., 3 kHz start, 1.5 kHz end) to maintain lock-on under low-signal conditions.
