قياس التعبير الجيني في طبقات الارون الشعير قصفت مع زيادة الإنتاجية

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس التعبير الجيني من تركيبات المراسلين بعد إدخالها في خلايا الشعير أليرون عن طريق قصف الجسيمات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في التعبير الجيني المنظم بالهرمونات النباتية مثل كيفية عمل جزيئات إشارات معينة لتنظيم حمض الأبسيسيك في الجينات التي يسببها الشعير. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر إنتاجية أعلى من الطرق السابقة ، مما يسمح باختبار عدد كبير من التركيبات الجينية وظروف الحضانة.

ستظهر البروتوكول جريس ، طالبة في مختبري. أولا ، ضع بعض الحبوب الخالية من الأجنة في غطاء طبق بتري بلاستيكي مقاس 90 ملم يحتوي على 20 مل من محلول الشرب و 20 ميكرولترا من الكلورامفينيكول. باستخدام ملقط معقم ، قم بإزالة طبقة البذور الشفافة برفق من كل حبة.

تقشير طبقات البذور من حبوب الشعير خطوة حاسمة. إذا لم تتم إزالة طبقات البذور بالكامل ، منع الناقلات الدقيقة الذهبية من دخول خلايا aleurone. ولكن إذا تم التقشير بشكل خشن للغاية ، فقد تتلف خلايا الأليرون.

بعد تقشير طبقة البذرة من جميع الحبوب ، انقلها من طبق بتري إلى طبق الفيرميكوليت. ثم ضع الحبوب الخالية من الجنين المقشرة في حاضنة على حرارة 24 درجة مئوية لمدة 16-20 ساعة. الآن ، قم بتسمية أنبوب واحد من خمسة ملليلتر من كل علاج سيتم تضمينه في تجربة القصف.

إلى كل أنبوب ، أضف نقطتين وخمسة ميكروغرامات من بلازميد التحكم الداخلي لوسيفيراز UBI ، ونقطتين وخمسة ميكروغرامات من بلازميد مراسل GUS والكمية المطلوبة من بلازميد المستجيب. أضف الماء فائق النقاء إلى كل أنبوب ليصل الحجم الإجمالي إلى خمسة ميكرولترات. لكل علاج ، أضف 50 ميكرولترا من الناقلات الدقيقة المعلقة في 50٪ من الجلسرين في كل أنبوب مكون من خمسة ملليلتر يحتوي على الحمض النووي البلازميد.

في الخطوة الأخيرة من إجراء ترميز الموجة الحاملة الدقيقة، ضع الماصة ثمانية ميكرولترات من الناقلات الدقيقة المعلقة على كل من الناقلات الكبيرة الخمسة واتركها تجف في الهواء. قم بإعداد جهاز قصف الجسيمات عن طريق تشغيل مضخة التفريغ ، وفتح صمام الهيليوم ، ثم تشغيل نظام توصيل الجسيمات. ضع قرص تمزق 1550 رطل لكل بوصة مربعة في غطاء التثبيت وقم بتثبيته على نظام توصيل الجسيمات.

ضع حاملا كبيرا يحتوي على تركيبة البلازميد المطلوبة مع شاشة توقف في مجموعة إطلاق الموجة الحاملة الصغيرة. أدخل المجموعة في الفتحة العلوية لغرفة القصف. بعد ذلك ، رتب ثماني حبيبات عديمة الأجنة في نمط شعاعي ضيق مع توجيه الأطراف الرقيقة إلى الداخل على دائرة ورق ترشيح يتم لصقها بشكل مسطح على غطاء طبق بتري سعة 90 مل.

ضع الطبق مع الحبوب في غرفة القصف على مسافة ستة سنتيمترات من شاشة التوقف. أغلق الباب واضغط على مفتاح التفريغ لإخلاء غرفة القصف إلى 95 كيلو باسكال. قم بتحويل مفتاح التفريغ بسرعة إلى وضع الانتظار.

ثم اضغط باستمرار على مفتاح النار لقصف العينة. بعد تحرير الفراغ ، انقل الحبوب المقصفة إلى طبق بتري مسمى 60 ملم يحتوي على أربعة ملليلتر من محلول الشرب مع مليغرام واحد لكل مليلتر من الكلورامفينيكول. كرر حتى يتم الانتهاء من جميع عمليات القصف.

بعد ذلك ، احتضان الحبوب المقصف على منصة اهتزاز عند 100 دورة في الدقيقة عند 24 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. باستخدام الملقط ، قم بإزالة الحبوب الثمانية التي تم قصفها من طبق بتري مقاس 60 ملم وامسحها حتى تجف على منشفة ورقية. قسم الحبوب إلى أنبوبين مليلترين ، يحتوي كل منهما على 800 ميكرولتر من عازلة الطحن وحبة من الفولاذ المقاوم للصدأ بسعة خمسة ملليمترات.

بعد تكرار الخطوة السابقة لجميع الحبوب التي تم قصفها ، ضع ما يصل إلى 48 أنبوبا ملليلترين في رفين من الخالط الخرز. ثم قم بتركيب الرفوف على الخالط ورج العينات عند 30 هرتز لمدة ثلاث دقائق. عند الانتهاء ، قم بإزالة الرفوف من الخالط وضعها على الثلج لمدة خمس دقائق لإعادة تبريد العينات.

الآن ، قم بتركيب الرفوف على الخالط في الاتجاه المعاكس. رج العينات مرة أخرى عند 30 هرتز لمدة ثلاث دقائق. بعد إزالة الرفوف من الخالط ، ضعها على الثلج لمدة خمس دقائق لإعادة تبريد العينات.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لمستخلصات الحبوب عند 16،000 جم عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. مباشرة بعد الطرد المركزي ، صب المواد الطافية الصافية في مجموعة ثانية من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. دوامة كل أنبوب لفترة وجيزة وتخزينها على الجليد.

بعد نقل المادة الطافية ، استرجع حبات الفولاذ المقاوم للصدأ من الكريات حتى يمكن غسلها وإعادة استخدامها. أضف الآن 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفحص GUS إلى كل بئر من لوحة 96 بئرا. ضع 50 ميكرولترا من كل مستخلص حبوب في أحد الآبار واخلطه بطرف الماصة.

ثم أغلق الجزء العلوي من اللوحة بغشاء مانع للتسرب. ضع الطبق المكون من 96 بئرا في حاضنة في الظلام على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20 ساعة. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للوحة 96 بئرا عند 4،000 جم عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.

عند الانتهاء ، ضع الطبق على الثلج. الآن ، أضف 250 ميكرولتر من صفر نقطة اثنين من مولر كربونات الصوديوم إلى كل بئر من صفيحة سوداء مكونة من 96 بئرا. أضف ستة نقاط واثنين وخمسة ميكرولتر من كل خليط فحص GUS بالطرد المركزي في كل بئر من الصفيحة السوداء واخلطها بطرف الماصة.

تشمل الآبار التي تحتوي على ستة نقاط اثنين وخمسة ميكرولتر من 10-40 عند 100 ميكرومولار ، وأربعة ميثيلمبليفرون كمعايير. ضع اللوحة السوداء في مقياس فلورومتر. اقرأ تألق methylumbelliferone الذي يحدد كسب الأداة ، بحيث يعطي البئر الذي يحتوي على ستة نقاط واثنين وخمسة ميكرولتر من 40 ميكرومولار ، وأربعة ميثيل أومبليفيرون و 250 ميكرولتر من كربونات الصوديوم المولية لنقطة الصفر ، وتعطي قراءة 100 وحدة مضنية.

في هذه التجربة ، تم إدخال بنية مراسل HVA1 GUS في خلايا aleurone جنبا إلى جنب مع بنية مستجيب UBI TaABF1. في حين أن نسبة TaABF1 HVA1 البالغة نقطة صفر فقط ، إلا أن نقطة صفر واحدة كانت كافية لإحداث ثلاثة أضعاف لجين مراسل HVA1 في غياب حمض الأبسيسيك الخارجي أو ABA. أدت المستويات الأعلى من بناء TaABF1 إلى زيادة تعبير HVA1 بشكل تدريجي بطريقة تعتمد على الجرعات.

يمكن لكل من exogenis ABA و TaABF1 أن يحفز بقوة التعبير عن بناء مراسل HVA1 GUS. في كلتا الحالتين ، أدى وجود بوتانول واحد إلى تثبيط تحريض HVA1 بشدة ، مما يشير إلى أن الفوسفوليباز D يمكن أن يلعب دورا مهما في تنشيط التعبير الجيني HVA1 بواسطة ABA من خلال TaABF1. تبين أن ABA يثبط بقوة التعبير الناجم عن الجبرلين لبناء مراسل Amy32b GUS.

في حين أنه لم يتسببا في أي انخفاض كبير من بيروكسيد الهيدروجين ولا نيتروبروسيد الصوديوم. وبالتالي ، فإن هذه النتائج لا تدعم دور أكسيد النيتريك وبيروكسيد الهيدروجين في استجابات ABA لخلية اليورون. بمجرد إتقانها ، يمكن أن تسمح هذه التقنية بقياس العديد من العينات المختلفة للتعبير الجيني في وقت قصير نسبيا.

على سبيل المثال ، يمكن قصف 200 عينة مختلفة من الحبوب من قبل محققين في غضون ساعتين. بعد ذلك ، في اليوم التالي ، يمكن لمحقق واحد تحضير جميع مستخلصات البروتين في ساعتين. يتطلب اختبار GUS المعدل الذي يتم إجراؤه في ألواح 96 بئرا أيضا عمالة أقل بكثير من البروتوكولات الأخرى التي تستخدم في فحوصات الأنبوب المستقبلية.