الكروماتين انتشار الأعمال التحضيرية لتحليل تطور البويضات الماوس من الطور الأول الطورية الثاني

الهدف العام من إعداد انتشار الكروماتين هذا هو تصور أنماط التوطين الديناميكي للبروتينات المرتبطة بالكروماتين ومورفولوجيا الكروموسومات للبويضات في جميع أنحاء تكوين بويضات الثدييات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا التناسلية الأنثوية ، مثل إقران الكروموسوم المتماثل ، والمشابك العصبي ، وإصلاح الحمض النووي ، وفصل الكروموسوم الانتصافي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بوضع العلامات المناعية الواضحة وتصور البروتينات المرتبطة بالكروموسومات وتقييم تعدد البويضات.

تكوين البويضات عرضة للخطأ ، وغالبا ما يؤدي خطأ الكروموسوم إلى مرض وراثي. يمكن استخدام هذه الطريقة لتحسين فهمنا لأسباب اختلال الصيغة الصبغية والعقم الأمومي. بعد القتل الرحيم لأنثى الفأر بعد 14 إلى 19 يوما من الجماع ، قم بعمل فتحة على شكل حرف V في تجويف البطن والحوض.

ثم قم بإزالة قرن الرحم الأم. بعد ذلك ، افصل الأجنة عن المشيمة ، وضحي بالأجنة بقطع الرأس. ثم انقلها إلى طبق بتري مقاس 35 ملم يحتوي على ثلاثة ملليلتر من PBS عند 37 درجة مئوية.

ثم انقل جروا واحدا إلى طبق منفصل محمل أيضا ب PBS الدافئ. بعد القتل الرحيم للجنين ، قم بعمل قطع على طول خط الوسط البطني للنصف الخلفي ، على طول النصف الأمامي أسفل الأطراف الأمامية ، وفوق الأطراف الخلفية والذيل مباشرة. بعد ذلك ، افتح بطن الجنين باستخدام مقص 3.5 بوصة.

باستخدام ملقط رفيع الرؤوس ، قم بإزاحة أو إزالة الكبد وحلقات الأمعاء ، وتعريض الغدد التناسلية. حدد الآن ما إذا كانت الغدد التناسلية من الذكور أو الإناث. يقع المبيضان أسفل الكلى وخلفها مباشرة ، باتجاه الجدار الخلفي للتجويف البريتوني.

قم بإزالة كلا المبيضين باستخدام زوج من الملقط ذي الرؤوس الدقيقة ، وانقلهما إلى وعاء صغير يحتوي على PBS يتم الحفاظ عليه عند 37 درجة مئوية. استمر بسرعة في جمع المبايض من جميع الأجنة. بعد ذلك في وعاء صغير جديد ، اغمر كل مجموعة منفصلة من المبايض تماما في نصف مليلتر من المخزن المؤقت الطازج لاستخراج المياه.

دعهم يحتضنون عند 25 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل ، ولكن ليس أكثر من 30 دقيقة. أثناء الحضانة ، استخدم قلم PAP حاجز كاره للماء لرسم مربعين مقاس 22 × 22 ملم على شريحة زجاجية نظيفة. قم بإعداد شريحة واحدة لكل مجموعة من المبايض.

عند اكتمال الحضانة ، أضف قطرة 50 ميكرولتر من 100 مللي مولار من السكروز إلى شريحة نظيفة ، وانقل زوجا واحدا من المبايض إلى القطرة. استخدم الآن إبرتين بقياس 27 لإثارة المبايض وإطلاق الخلايا فيها. باستخدام ملقط ، قم بإزالة قطع المبيض الكبيرة والتخلص منها.

ثم ماصة محلول السكروز بعناية لتفريق الخلايا التي تم إطلاقها. بعد ذلك ، قم بتحميل كل مربع على شريحة تحتوي على 40 ميكرولتر من 1٪ PFA مع 0.2٪ Triton X-100. انشر المحلول حول المربع باستخدام طرف ماصة أو عن طريق هز الشريحة ذهابا وإيابا.

ثم لكل مجموعة من محلول السكروز مع الخلايا ، قم بتحميل بركتين مثبتتين ب 20 ميكرولترا من الخلايا العالقة بحيث تحتوي كل شريحة على خلايا من مجموعة واحدة من المبايض. بالنسبة لمجموعات بويضات MI أو MII ، قم أولا بإعداد الفأر المتبرع وقتله رحيما. ثم قم بعمل فتحة كبيرة على شكل حرف V في تجويف البطن والحوض ، واستخدم الملقط لإزاحة الأمعاء لتحديد موقع كل قرن رحمي.

ابحث عن المبايض القريبة من القفص الصدري. امسك قناة البيض بالملقط الناعم ، وقطع الدهون فوق المبيض باستخدام مقص التشريح. بينما لا تزال تمسك قناة البيض ، استخدم ملقطا دقيقا لتحرير المبيض من الجراب ، وانقل المبايض إلى طبق تجميع يحتوي على وسط يتم الحفاظ عليه عند 37 درجة مئوية.

لجمع البويضات في مرحلة GV ، استخدم حقنة سعة ملليلتر واحد بإبرة قياس 27 لتحرير مجمعات البويضات الركامية عن طريق ثقب البصيلات التاجية الكبيرة يدويا. لجمع بويضات مرحلة MII ، قم بتمزيق ثقب في أمبولة قناة البيض لإطلاقها بدلا من مجرد عمل ثقب. الآن اجمع البويضات باستخدام ماصة زجاجية تعمل بالفم أو شعرية ، أو استخدم حقنة ميكرومتر تعمل يدويا.

قد تكون بعض البويضات محاطة بالخلايا الركامية ، والبعض الآخر لا. بالنسبة لبويضات MI ، قم بإعداد الهيالورونيداز الطازج في MEM-alpha / BSA لتعرية بويضات الخلايا الركامية المحيطة. لكل مجموعة من البويضات ، قم بمعالجتها في حاضنة مع 2.5 مل من الهيالورونيداز المحضر لمدة ثلاث دقائق.

ثم انقل بويضات MI إلى وسط MEM-alpha / BSA الدافئ الطازج. هناك ، استخدم ماصة زجاجية تعمل بالفم لتوفير قوة القص اللازمة لفصل الخلايا الركامية تماما. بشكل عام ، يتطلب نجاح هذا الإجراء إتقان جمع البويضات ومعالجتها باستخدام الماصات الزجاجية أو الشعيرات الدموية التي تعمل بالفم.

اسمح للبويضات بالتعافي في الحاضنة. في هذه الأثناء ، في لوح زجاجي ساخن من تسعة آبار ، قم بتحميل 300 ميكرولتر من محلول Tyrode الدافئ. قم بتحميل بئرين ب 300 ميكرولتر من MEM-alpha / BSA الدافئ ، وقم بتحميل بئر واحد ب 300 ميكرولتر من وسط Waymouth الدافئ.

لإزالة المنطقة الشفافة ، انقل خمسة إلى 10 بويضات MI أو MII في حمام محلول Tyrode لمدة 30 إلى 45 ثانية فقط أثناء مشاهدتها تحت مجهر التشريح. عندما يتم إذابة المنطقة الشفافة بشكل واضح ، انقل البويضات على الفور إلى الوسط باستخدام ماصة مبللة مسبقا بوسط MEM-alpha / BSA. ثم انقل البويضات إلى حمام ثان من وسط دافئ.

بعد الحمام الثاني ، انقل البويضات إلى وسط وايموث الدافئ ، واتركها تتعافى في حاضنة لمدة 30 دقيقة. للتحضير لانتشار الكروماتين ، استخدم قلم PAP لرسم مستطيل 11 × 44 ملم على شريحة زجاجية. بعد ذلك ، قم بتغطية الشريحة بطبقة رقيقة من 1٪ PFA مع 0.2٪ Triton X-100 في الماء ، ثم قم بهز الشريحة ذهابا وإيابا لنشر المحلول.

ثم اضغط على الشريحة لإزالة الفائض. الآن سيفون ما بين خمسة و 10 بويضات مع الحد الأدنى من المتوسط. ثم انقل البويضات إلى الشريحة المحضرة عن طريق سحب طرف الماصة في نفس الوقت عبر المحلول المثبت وإسقاط البويضات على الشريحة من حوالي سنتيمتر واحد أعلاه.

يجب أن تنفجر البويضات على الفور ، وتنشر الكروماتين على الشريحة. الآن احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطبة مغلقة. دعهم يستقرون طوال الليل حتى يلتصق الكروماتين بالشريحة.

تم استخدام مجموعة الكروماتين الجنينية الموصوفة لتحليل التكوين المتقاطع كميا في البويضات التي تم حصادها من أجنة C57 السوداء / 6J. تم وضع علامة مناعية على مستحضرات انتشار كروماتين الطور للكشف عن SYCP3 و SYCP1 و MLH1 ، وتلطيخها ب DAPI. تحتوي كروموسومات مرحلة Pachytene على 27 بؤرة MLH1 موزعة على طول 20 هيكلا SC مجمعة بالكامل.

عندما كان تحضير الانتشار دون المستوى الأمثل ولم يكن من الممكن تمييز الكروموسومات الفردية ، لم يتم تضمين المستحضر في التقييم. في الاستعدادات الجيدة ، تم إثراء SMC6 في منطقة الكروماتين المتغاير حول المركز وعلى طول أذرع الكروموسوم ، وتم توزيع بؤر MLH1 على طول SC في مرحلة الباشيتين. كان عدد عمليات الانتقال الإيجابية ل MLH1 من 15 استعدادا جيدا من النوع البري حوالي 24.

تم استخدام طريقة جمع البويضات لتقييم مورفولوجيا الكروماتين في البويضات بعد استئناف الانتصاف. تم تقييم توطين البروتين ، وكذلك ploidy ، بسهولة ، مما كشف عن الأسباب المحتملة لأخطاء فصل الكروموسومات. يمكن رؤية Topoisomerase II-alpha على طول أذرع الكروموسوم والكروماتين المتغاير حول المركز.

في بويضات MII ، يمكن تمييز الكروماتيدات الشقيقة المزدوجة عن طريق مورفولوجيا الكروموسوم والسنترومير. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنيات بدون أو بعد الزراعة في غضون ساعة أو ساعتين لكل فأر. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق تكميلية أخرى ، مثل وضع العلامات المناعية لبويضة الخلية الكاملة وتصوير الخلايا الحية لتقييم الكروموسومات المتجانسة والكروماتيدات الشقيقة في سياق الخلية.

بشكل جماعي ، يمكن تطبيق طرق انتشار الكروماتين الموضحة هنا بسهولة لتقييم تكوين بويضات الثدييات والسمات ثنائية الشكل جنسيا لديناميكيات الكروموسوم والبروتين أثناء الانقسام الاختزالي.