التصور "تشكيل بيوفيلم" في المبيضات البيض باستخدام جهاز موائع جزيئية الآلي

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تصور تكوين الأغشية الحيوية للمبيضات البيضاء في الوقت الفعلي في ظل الظروف الفسيولوجية المضيفة. تتيح هذه الطريقة مراقبة تكوين الأغشية الحيوية أثناء تطوره في الوقت الفعلي ويمكن استخدامها لاختبار فعالية العوامل المضادة للميكروبات أو لتقييم الطفرات الجينية. يمكن استخدام هذه التقنية لفحص العلاجات المحتملة للنشاط ضد الأغشية الحيوية بطريقة عالية الإنتاجية ويمكن قياس فعاليتها وتصورها ومقارنتها بالعلاجات الحالية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن استخدامها لفحص تكوين الأغشية الحيوية في ظل عدة ظروف مختلفة تهم الباحثين. على الرغم من أن هذه الطريقة تم تطويرها خصيصا لدراسة تكوين الأغشية الحيوية المبيضات البيضاء ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الكائنات الحية الدقيقة الأخرى المكونة للأغشية الحيوية بما في ذلك الأنواع الفطرية الأخرى وكذلك البكتيريا. للبدء ، قم بإعداد مزارع مستعمرة واحدة من سلالات مختلفة من C.albicans من الخلايا المطلية بمستخلص الخميرة بسكر العنب أو أجار متوسط YPD باتباع الممارسات الميكروبيولوجية القياسية.

بعد ذلك ، قم بتشغيل نظام الموائع الدقيقة الذي يتضمن وحدة التحكم ووحدتي إمداد الطاقة والمجهر والكاميرا والكمبيوتر المتصل بالنظام. بمجرد تحميل الكمبيوتر ، افتح البرنامج الذي يتحكم في النظام. حدد موقع رقم الباركود للوحة المستخدمة وأدخل الرقم عندما يطلب البرنامج ذلك.

ثم في وحدة التحكم ، اضبط درجة حرارة نظام الموائع الدقيقة على 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، انقر فوق آبار المدخل I1 و I7 و I13 و I19 وقم بتدفق الهواء المعقم عبر أنابيب لوحة الواجهة لمدة خمس دقائق لإزالة أي تكاثف. عندما يتبخر كل التكثيف ، ضع لوحة الموائع الدقيقة المكونة من 48 بئرا 0-20 على مرحلة المجهر.

لتجربة تكوين الأغشية الحيوية لمدة 12 ساعة ، ابدأ بإضافة 600 ميكرولتر من الوسط الدافئ مسبقا إلى آبار المدخل. قم بخفض لوحة الواجهة التي تم تنظيفها ببطء أعلى لوحة الموائع الدقيقة المكونة من 48 بئرا. ثم حرك لوحة الواجهة قليلا إلى اليسار حتى يتم وضع الأنابيب أعلى آبار المدخل والمخرج ويتم تثبيتها في موضعها.

في قسم التحكم في القص في البرنامج ، اضبط وضع التدفق على ثابت واضبط الحد الأقصى للقص على داين واحد لكل سنتيمتر مربع. ثم انقر فوق آبار المدخل مع الوسائط لبدء تدفق الوسائط من المدخل إلى آبار المخرج من أجل تجهيز القناة. بعد خمس دقائق من التدفق ، انقر فوق زر الإيقاف في قسم التحكم في لوحة البئر في البرنامج.

ثم قم بإزالة لوحة الواجهة وراقب آبار الألواح الدقيقة. يجب أن تكون قطرة صغيرة فقط من الوسائط مرئية في آبار المخرج. لاختبار سلالات C.albicans من النوع البري والمتحورة ، أضف 50 ميكرولترا من ثقافة الخلايا SC5314 من النوع البري في وسائط العنكبوت إلى بئرين منفذين ، وأضف متحولة bcr1 في وسائط العنكبوت إلى بئرين منفذين وأضف متحولة EFG1 في وسائط العنكبوت إلى بئرين منفذين.

ضع لوحة الواجهة مرة أخرى على لوحة الموائع الدقيقة وقم بتثبيت الغطاء في مكانه. مرة أخرى في قسم التحكم في القص في البرنامج ، اضبط وضع التدفق على ثابت واضبط الحد الأقصى للقص على اثنين من السنتيمتر المربع. انقر فوق آبار المخرج مع الخلايا لبدء تدفق الوسائط من المخرج إلى آبار المدخل لبدء بذر C.albicans.

بعد ثلاث ثوان ، انقر فوق زر الإيقاف في قسم التحكم في لوحة البئر لمنع الخلايا من دخول آبار المدخل. اسمح للخلايا بالبقاء ثابتة بدون تدفق لمدة 10-20 دقيقة في قناة العرض للالتصاق الأولي للخلية. في نافذة وحدة التصوير ، افتح وحدة الاستحواذ متعددة الأبعاد وانقر على علامة تبويب المرحلة في القائمة الموجودة على الجانب الأيسر.

في قسم المرحلة ، قم بتحميل قائمة المرحلة الرئيسية للوحة الموائع الدقيقة 48 بئرا 0-20. بعد ذلك ، افتح ضبط إعادة تحميل العينة وانقل المرحلة إلى وحدات الموضع المطلق. في وحدة ضبط إعادة تحميل العينة، اضغط على الزر المباشر لمشاهدة معاينة الصورة مع الشعيرات المتقاطعة.

باستخدام عصا التحكم ، ضع لوحة البئر بحيث يتماشى طرف السهم المجاور لقناة العرض الرابعة مع الشعيرات المتصالبة على البرنامج. ثم انتقل إلى مرحلة الانتقال إلى قائمة الموضع المطلق واضغط على زر تعيين الأصل. بعد ذلك ، ارجع إلى وحدة ضبط إعادة تحميل العينة ، وانقر فوق قسم النقطة المرجعية الأولية في القائمة اليسرى وقم بتحميل الملف للوحة الموائع الدقيقة 48 بئرا 0-20.

في قسم المسرح من وحدة الاستحواذ متعددة الأبعاد، انقر نقرا مزدوجا فوق موضع المسرح 22.2 لإحضار مرحلة عرض المجهر وتركيز الكاميرا بالقرب من علامة السهم من خلال عرض القناة 22. ثم استخدم عصا التحكم لوضع لوحة البئر بحيث يتماشى طرف السهم المجاور لقناة العرض 22 مع الشعيرات المتصالبة. انسخ الإحداثيات Y في وحدة الاستحواذ متعددة الأبعاد إلى الموضع Y.

2 في علامة التبويب تحديث النقاط المرجعية في الوحدة النمطية لضبط إعادة تحميل العينة. أخيرا، في علامة التبويب تحديث مواضع المرحلة في وحدة ضبط إعادة تحميل العينة، انقر فوق تطبيق على قائمة مراحل MDA. في نافذة وحدة التصوير ، استخدم وحدة الاستحواذ متعددة الأبعاد وانقر فوق علامة التبويب حفظ في القائمة اليسرى.

ثم حدد اسم الملف للتجربة والمجلد لتخزين الصور المكتسبة على الكمبيوتر. بعد ذلك ، انقر فوق علامة التبويب الفاصل الزمني واضبطها للحصول على 145 صورة إجمالية لمدة خمس دقائق بين كل صورة. ثم في علامة التبويب الأطوال الموجية ، اضبط عدد الأطوال الموجية على واحد والتقط عند 50٪ Brightfield و 50٪ كاميرا مع وقت تعرض يتراوح من 12 إلى 20 مللي ثانية.

اضبط الكسب على 0.6 والمحول الرقمي على 20 مللي هرتز. بعد تعيين التركيز كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب، حدد اكتساب لبدء التقاط صور ما قبل التدفق للخلايا الملتصقة لجميع المراحل الفرعية. في قسم التحكم في القص ، اضبط وضع التدفق على ثابت والحد الأقصى للقص على مربع داين واحد لكل سنتيمتر.

ثم انقر فوق آبار المدخل لبدء تدفق الوسائط من آبار المدخل إلى المخرج لإزالة أي خلايا غير ملتصقة. بعد خمس دقائق ، انقر فوق زر الإيقاف في قسم التحكم في لوحة البئر. اسمح بالحصول على جولة ثانية من الصور ثم في قسم التحكم في القص ، اضبط الحد الأقصى لتدفق القص إلى 0.5 داين لكل سنتيمتر مربع وتأكد من التغيير.

في نافذة وحدة التصوير، حدد علامة التبويب أدوات التحليل وانقر فوق مراجعة البيانات متعددة الأبعاد من القائمة المنسدلة. ثم انقر فوق تحديد الملف الأساسي. سيؤدي هذا إلى فتح نافذة الأدوات المساعدة لمجموعة البيانات متعددة الأبعاد.

بعد ذلك ، انقر فوق زر تحديد الدليل واختر المجلد الذي تم استخدامه لحفظ التجربة. في قائمة مجموعات البيانات، حدد سجل ملف التجربة. بمجرد تحميل السجل ، انقر فوق زر العرض.

حدد الطول الموجي بالنقر فوق الخيارات الموجودة في قائمة الأطوال الموجية اليسرى واختر موضع المسرح المراد عرضه من القائمة المنسدلة. اختر الصورة المراد تحميلها من الأرقام الموجودة أعلى الوحدة بالنقر بزر الماوس الأيمن فوق رقم الصورة. ثم حدد جميع الصور لإنشاء فيديو بفاصل زمني.

سيتم فتح الصور المحددة كفيديو في نافذة جديدة. انقر فوق علامة تبويب الملف في نافذة وحدة التصوير واختر حفظ باسم من القائمة المنسدلة. احفظ الفيديو الناتج بتنسيق الملف الافتراضي.

أخيرا ، افتح ملف الفيديو المحفوظ وقم بتحميله في الصورة J.In الصورة J ، وانقر فوق علامة تبويب الملف ثم انقر فوق حفظ باسم. اختر AVI من القائمة المنسدلة وقم بتحويل الملف إلى ملف AVI باستخدام تحويل JPEG الذي تم تعيينه على 10 إطارات في الثانية. في ظل ظروف البرية في وسائط RPMI 1640 ، التزمت عدة خلايا بقوة بالقناة.

إنها تشكل خيوطا ويمكن ملاحظة غشاء حيوي سميك مع خلايا خيوط وخميرة متداخلة. قرب نهاية تجربة الموائع الدقيقة ، يملأ الأغشية الحيوية من النوع البري قناة المشاهدة هذه بالكامل. ومع ذلك ، فإن وجود الأمفوتريسين B له تأثير واضح على تقليل تكوين الأغشية الحيوية.

على وجه التحديد ، يتضاءل التصاق الخلايا ويمكن رؤية العديد من الخلايا تتدفق بعيدا مع تدفق القص للوسائط. شكلت خلايا التحكم من النوع البري ، التي نمت هذه المرة في وسائط العنكبوت ، غشاء حيويا مشابها لتلك التي ظهرت للتو وهي تنمو في RPMI. يزرع أيضا في هذه الوسائط نوعان من الطفرات المعيبة في الأغشية الحيوية.

تظهر كلتا السلالتين انخفاضا حادا في تكوين الأغشية الحيوية مقارنة بالسيطرة. في هذه المجموعة من الخلايا ، لا تشكل الخلايا الملتصقة خيوطا ويكون الأغشية الحيوية الناتجة معيبة بشدة. هذه السلالة الأخرى معيبة في تكوين الأغشية الحيوية وفي قدرتها على الالتصاق بالقناة.

بمجرد إتقان هذه التجربة ، يمكن إعداد هذه التجربة في أقل من ساعة. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن للمرء أن يتعلم الكثير عن عدد من الجوانب المختلفة لتكوين الأغشية الحيوية بما في ذلك الالتصاق الأولي للخلية ، ونضج الأغشية الحيوية ، وتشتت الخلايا. هذا البروتوكول قابل للتخصيص بدرجة كبيرة ومتعدد الاستخدامات.

يمكن تعديله لتقييم الأنواع الميكروبية المختلفة عبر الممالك. يمكن أيضا استخدام معدلات التدفق ودرجات الحرارة وأوقات الحضانة والوسائط لدراسة الأغشية الحيوية للأنواع المختلطة. نوصي بشدة باختبار الأغشية الحيوية للموائع الدقيقة هذا كمقايسة في المختبر لاستخدامها قبل الاختبار على في الجسم الحي.

في تجربتنا ، ترتبط نتائج هذا الاختبار بشكل جيد للغاية مع فحوصات الأغشية الحيوية الموجودة في الجسم الحي.