إنشاء مقايسة الاستعمار الرئة لتعميم التصور خلية الورم في أنسجة الرئة

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال ورم خبيث للسرطان حول دور استعمار الرئة في تحقيق ورم خبيث للسرطان. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تصور الخلايا السرطانية المبكرة في الرئتين أثناء ورم خبيث سرطاني. سيوضح الإجراء تشنغ هان يانغ ، طالب دكتوراه من مختبري.

عندما تصل ثقافة الخلايا السرطانية إلى 70 إلى 80 في المائة من التقاء ، اغسل المزرعة مرتين في ملليلترين من PBS المعقم لكل غسلة ، وأضف ملليلتر واحد من 0.5٪ Trypsin-EDTA إلى طبق الاستزراع. قم بإزالة 800 ميكرولتر من المادة الطافية على الفور وضع طبق الثقافة على 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 60 ثانية حتى تنفصل غالبية الخلايا عن اللوحة. أضف ملليلتر واحدا من الوسط الطازج، مع استكمال 10٪ FBS لإيقاف التفاعل واستخدم ماصة سعة 1000 ميكرولتر لخلط محلول الخلية بقوة.

انقل المعلق أحادي الخلية الناتج إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مليلتر وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي. ثم أعد تعليق حبيبات الخلية السرطانية في 1.5 مل من الوسط المكمل بنسبة 20٪ FBS, ونهاية النهاية لتدوير الخلايا لمدة ساعتين, عند 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة ، قم بحساب الخلايا القابلة للحياة عن طريق استبعاد الtrypan blue وجمعها عن طريق الطرد المركزي.

أعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من PBS المعقم لطرد مركزي ثان وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من PBS مكملة ب 10٪ FBS و 20 ميكرو ملليلتر CFSE. بعد عشر دقائق عند 37 درجة مئوية في الظلام ، قم بالطرد المركزي للخلايا ، وأعد تعليق الحبيبات في أربعة ملليلتر من الوسط مع واحد بالمائة FBS لطرد مركزي آخر. بعد الغسيل الأخير، أعد تعليق الخلايا إلى خمسة في عشرة إلى الخلايا السرطانية السادسة لكل مليلتر من وسط طازج دون تركيز FBS، وضع الخلايا على الجليد.

بعد ذلك ، قم بتسخين ذيل فأر ذكر C570 Black Six يبلغ من العمر أربعة إلى ستة أسابيع لمدة خمس إلى عشر دقائق لتوسيع عروق الذيل واستخدم حقنة سعة ملليلتر واحد مزودة بإبرة قياس 26 ونصف لخلط الخلايا جيدا حتى يتم تحقيق تعليق خلية واحدة. قم بتحميل المحقنة بعناية ب 200 ميكرولتر من الخلايا وضع الماوس في مصفاة. ثم حقن الحجم الكامل للخلايا في تجويف وريد الذيل المتوسع.

في الفترة الزمنية المناسبة بعد الحقن ، قم بعمل شق طولي في الجلد والأنسجة تحت الجلد من البطن إلى الصدر وافتح التجويف الجنبي لكشف القلب والرئتين. باستخدام خيوط جراحية معقمة ، قم بربط الوريد الأجوف العلوي والسفلي لمنع ارتجاع محلول الوفرة واستخدم المقص لعمل شق من ملليمترين إلى أربعة ملليمترات في البطين الأيسر لتسهيل تصريف الإفراغ من الرئتين. ثم استخدم حقنة سعة ثلاثة ملليلتر لحقن PBS في البطين الأيمن واستخدم الشفط المستمر لإزالة المحلول المصفى حتى تتغير الرئتان من لون ضارب إلى الحمرة إلى اللون الباهت تماما.

احرص على تأمين الوريد الأجوف العلوي والسفلي بشكل صحيح من أجل نضح الرئة بنجاح. بعد حصاد الرئتين ، ضع الفصوص في حامل رئة مخصص في طبق طوله ستة سنتيمترات ، وقم بتأمين الرئتين على الملمس الشبكي للحامل. قم بتغطية الفصوص وترطيبها باستخدام PBS ، وضع طبق الثقافة في مرحلة التصوير من المجهر متحد البؤر.

حدد الهدف 5x ، وقم بتدوير عجلة المرشح إلى NIBA. باستخدام ليزر 488 نانومتر ، قم بإثارة CFSE للسماح بتصور واضح للخلايا السرطانية ذات اللون الأزرق الفلوري داخل فصوص الرئة. قم بتدوير عجلة المرشح إلى R690 للمسح الضوئي بسرعة مسح ضوئي بمقدار ميكروثانية لكل بكسل وتحسين مستويات كسب الجهد العالي والإزاحة.

ثم التقط خمس صور فلورية بدقة 12 × خمس بكسل 12 بكسل باستخدام سرعة مسح ضوئي تبلغ 10 ميكروثانية لكل بكسل. باستخدام طريقة التلوين كما هو موضح للتو ، يتم تصنيف الخلايا السرطانية بشكل فعال مع CFSE بطريقة تعتمد على الجرعة. مع شدة التألق في الملصقات ، تصل تقريبا إلى هضبة في ستة أضعاف 10 إلى خلايا سرطان الرئة الخامسة من لويس لكل مليلتر بتركيز 20 ميكرومولار.

تروية الرئة قبل الحصاد كما هو موضح للتو يزيل الأوعية الدموية الرئوية للخلايا السرطانية المنتشرة غير المفرومة بشكل غير محدد قبل تحليل التصوير. يكشف الفحص المجهري متحد البؤر الفلوري عن وجود الخلايا السرطانية المستعمرة المسماة CFSE داخل فصوص الرئة المحصودة والمنفخة. استخدام برنامج مناسب لتحليل الصور لتحويل الصور الفلورية إلى الأبيض والأسود ، يسهل القياس الكمي لاستعمار الرئة.

يظهر التوصيل عن طريق الوريد للفيبرونيكتين الذي يعبر عن فيبرونيكتين الذي يعبر عن خلايا سرطان الرئة في لويس عددا أقل بكثير من الخلايا التي تعبر عن الفيبرونيكتين في أنسجة الرئة التي يتم حصادها بعد 38 و 45 ساعة من الحقن ، مما يؤكد دور الفيبرونيكتين في استعمار فص الرئة وتطور الورم. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تنقع الرئتين بعناية حتى يمكن غسل الخلايا غير المتصلة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال ورم خبيث للسرطان لاستكشاف استعمار الرئة عن طريق تدوير الخلايا السرطانية في نموذج صفر جرام للفأر.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تسمية معلقات الخلايا السرطانية بالفلورسنت ، وتلقيح الخلايا السرطانية عن طريق الوريد لفتيل رئتي الفأر ، واستخدام الفحص المجهري للزهار متحد البؤر لتصوير الخلايا السرطانية المنتشرة.