إنشاء ثقافة الأولية المستمدة من المريض الأنسجة اللينة كابوزي

الهدف العام لهذا النموذج البشري قبل السريري المشتق من أنسجة الورم المستصولة جراحيا هو الحصول على مزرعة أولية لساركوما الأنسجة الرخوة المشتقة من المريض. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول الفيزيولوجيا المرضية لساركوما الأنسجة الرخوة وتمثل أداة ما قبل السريرية المهمة للتنبؤ بالاستجابة للعلاج. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها نموذج قبل السريري البشري بالكامل.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج ساركوما الأنسجة الرخوة لأنه يمكن اختبار هذا النموذج قبل السريري باستخدام الأدوية التقليدية المبتكرة للتحقيق في نشاطها وآلية عملها. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لساركوما الأنسجة الرخوة ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على دراسة تفاعل خلايا الأنسجة الرخوة للخلايا السرطانية. سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب عدم تجانس أنسجة الورم وعزل الخلايا السرطانية.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن اختيار خلايا ساركوما الأنسجة الرخوة الأولية وخطوات القرص المضغوط تتطلب قدرا من الخبرة قبل تحقيق الكفاءة. يجب استلام عينات الورم في وعاء بول معقم سعة 100 مل مع 50 مل من وسط الجلوكوز المنخفض DMEM مختوم بغشاء البارافين. يمكن الاحتفاظ بالعينات عند أربع درجات مئوية لمدة أقصاها ثلاث ساعات بعد استئصال الورم.

تعقيم غطاء مزرعة الأنسجة بنسبة 70٪ من الإيثانول وتعقيم ملاقط INOX الفولاذية بنسبة 70٪ من الإيثانول. أخرج طبقة البارافين من وعاء البول وتخلص منها. نظف الجزء الخارجي من وعاء البول بنسبة 70٪ من الإيثانول.

افتح طبق بتري مربع ، ثم افتح وعاء البول واستخدم ملاقط INOX الفولاذية المعقمة لنقل عينات الورم إلى الطبق. أضف PBS واغسل عينة الورم مرتين. بعد الغسيل ، قم بتقطيع عينة الورم جيدا إلى قطع بحجم واحد إلى ملليمترين.

انقل ربع العينة الكلية إلى أنبوب ملليلتر. ثم أضف ملليلترا واحدا من كاشف TRIzol إلى الأنبوب وقم بتجميده على الفور عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. اجمع باقي مادة الورم المقطعة جيدا في أنبوب سعة 15 مليلتر وأضف أربعة ملليلتر من محلول الكولاجيناز من النوع الأول.

ثم قم بتخفيف محلول الكولاجيناز من النوع الأول بأربعة ملليلتر من وسط الثقافة ، وأغلق الأنبوب ، وأغلقه بغشاء البارافين. احتضن عند 37 درجة مئوية على شاكر متدحرج لمدة 15 دقيقة لتنشيط عملية الهضم. بعد 15 دقيقة ، ضع الأنبوب مع شاكر الدرفلة في درجة حرارة الغرفة واتركه طوال الليل.

في اليوم التالي ، قم بتصفية تعليق الخلية برفق من خلال مرشح معقم 100 ميكرون في أنبوب سعة 50 مل. ثم اغسل الفلتر بوسط الثقافة وقم بالطرد المركزي للمرشح عند 225 مرة جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية عن طريق قلب الأنبوب وأعد تعليق الخلايا بواحد إلى ملليلتر من وسط الاستزراع.

بعد إجراء إحصاء الخلايا وحساب رقم الخلية ، قم بوضع الخلايا في ثقافة أحادية الطبقة قياسية بكثافة 80،000 خلية لكل سنتيمتر مربع. لتحضير عينة خلوية ، ابدأ بجمع 100،000 خلية في 200 ميكرولتر من وسط الزراعة. قم بعرض المحلول في قمع يمكن التخلص منه ومجهز بمرشح ومثبت بشريحة زجاجية.

افتح جهاز الطرد المركزي الخلوي وأدخل العينات. بعد الطرد المركزي الخلوي ، تخلص من القمع المزود بالفلتر. ثم قم بإصلاح الشريحة في الأسيتون لمدة 10 دقائق ، متبوعا بالكلوروفورم لمدة خمس دقائق.

قم بتمرير خلايا STS عندما يكون التقاء حوالي 90٪ بعد غسل ورقة الخلية باستخدام PBS ، أضف ملليلترين إلى ثلاثة ملليلترات من 1X Trypsin في PBS واحتضانها لمدة ثلاث إلى خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، استخدم ماصة سعة 200 إلى 1,000 ميكرولتر لتجميع الخلايا المنفصلة ونقلها إلى أنبوب سعة 15 ملليلترا. أضف أربعة ملليلتر من الوسط لإيقاف التفاعل الأنزيمي.

ثم جهاز الطرد المركزي عند 225 مرة جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق حبيبات الخلية عن طريق إضافة مليلتر واحد من الوسط وبذر الخلايا في صفيحة ثقافة جديدة أو قارورة. تم عزل الخلايا السرطانية من الساركوما الشحمية التي تمت إزالتها جراحيا من مريض يبلغ من العمر 54 عاما.

تم إجراء التهجين الفلوري في الموقع للكشف عن تضخيم MDM2 في عينة أنسجة المريض. يؤكد التحليل الخلوي لتضخيم MDM2 في الخلايا السرطانية المعزولة إنشاء مزرعة أولية مشتقة من المريض. تم إحداث التغيرات المورفولوجية من القاعدة عندما عولجت الثقافات ب Ifosfamide و Epirubicin و Ifosfamide و Epirubicin و Trabectedin و Eribulin.

تم إجراء ثلاث نسخ مكررة مستقلة لكل تجربة جدوى. أكدت النتائج حساسية الثقافات للعلاج الكيميائي. كان العلاج الأكثر نشاطا هو الجمع بين Ifosfamide و Epirubicin ، وهو علاج من الخط الأول يستخدم في ALT-DDLPS المتقدم أو النقيلي.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون 15-16 ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تمزيق عينة الورم بدقة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء مجموعة متنوعة من التحليلات النهائية بما في ذلك التنميط الجيني أو التحليل الكيميائي المناعي أو فحص السمية الخلوية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية حول بيولوجيا ساركوما الأنسجة الرخوة.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال ساركوما الأنسجة الرخوة لدراسة التاريخ الطبيعي لهذه الأورام الخبيثة التي لم يتم استكشافها بشكل جيد. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء ثقافة أولية لساركوما الأنسجة الرخوة المشتقة من المريض. لا تنس أن العمل مع العينات البيولوجية والأدوية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات والعمل بغطاء الدخان أثناء تنفيذ هذا الإجراء.