الإعداد الأمثل من الفورمالين الثابتة عينات الببتيد تستند إلى مصفوفة بمساعدة الليزر التصوير مهام سير العمل الطيف الكتلي الامتزاز/التأين

الهدف العام من هذا الإجراء هو إعداد عينة من الأنسجة بشكل متكرر لتصوير قياس الطيف الكتلي للببتيد. تسمح هذه الطريقة لمستخدمي قياس الطيف الكتلي المبتدئين بتطوير سير عمل قياس الطيف الكتلي للتصوير الخاص بهم دون المرور بقرارات تجريبية مطولة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها قابلة للتكرار بدرجة كبيرة وسهلة التنفيذ وتستخدم منهجيات فعالة من حيث التكلفة.

لتحضير الشرائح المطلية بالنيتروسليلوز ، قم بوضع 40 ميكرولترا من النيتروسليلوز السائل على حافة واحدة من شريحة مجهر أكسيد قصدير الإنديوم الموصل. باستخدام شريحة مجهر زجاجي عادي ، اسحب النيتروسليلوز تحت التوتر السطحي عبر الشريحة لإنشاء طلاء رقيق متساو. اترك النيتروسليلوز يجف في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 ثانية ، ثم قم بتخزينه لحين الحاجة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، قم بإنشاء غرف بخار مخصصة عن طريق قطع قطعة من ورق النشاف السميك كبيرة بما يكفي لتناسب النصف السفلي من طبق بتري بلاستيكي قياسي. قص الورق لترك شريط مستطيل في المنتصف بنفس حجم شريحة المجهر. اترك فائضا كافيا حتى تحافظ الورقة على موقعها في طبق بتري.

بالنسبة لأنسجة FFPE ، قم بتركيب الأقسام على شرائح ITO المطلية مسبقا بالنيتروسليلوز كما هو موضح في بروتوكول النص. اغمر الشرائح في الزيلين الطازج لإزالة البارافين المتبقي لمدة دقيقتين. اغسل العينات التي تم إزالة الورق عن طريق غمر الشرائح في سلسلة مذيبات متدرجة تتكون من حجم 70٪ لمحلول ماء الإيثانول الحجمي ، متبوعا بنسبة 100٪ من الإيثانول ، لمدة 30 ثانية.

ثم اغمر الشرائح في سائل كارنوي لمدة دقيقتين. أخيرا ، اغمر الشرائح في سلسلة من الإيثانول بنسبة 100٪ ، والماء عالي النقاء ، والإيثانول بنسبة 100٪ مرة أخرى ، لمدة 30 ثانية. قم بتحميل شرائح العينة في صندوق منزلق بلاستيكي مملوء إلى الأعلى ب 20 مللي مولار تريس HCO.

أغلق الصندوق وضعه في حمام مائي يحتوي على 500 مل من الماء ، مما يسمح للصندوق بلمس قاع الحمام. ثم قم بتسخين الصندوق لمدة 15 دقيقة عند 120 درجة مئوية في قدر الضغط ، والذي يمكن أن يحقق ضغط تشغيل يبلغ 70 كيلو باسكال. قم بإزالة الشرائح واتركها لتبرد واتركها تجف في درجة الحرارة المحيطة لمدة 15 دقيقة.

بمجرد التحلل المائي ، قم بتغطية العينات ب 10 ميكرولتر من محلول التربسين في ماء فائق النقاء عن طريق سحب 10 ميكرولترات من المحلول أولا على حافة قسم الأنسجة. بعد ذلك، باستخدام نفس طرف الماصة، اسحب القطرة عبر سطح الأنسجة بالكامل تحت التوتر السطحي. بعد السماح للعينات بالجفاف في درجة الحرارة المحيطة ، قم بتثبيتها داخل الجزء العلوي من غرفة البخار التي تم إنشاؤها مسبقا بشريط الأوتوكلاف على أي من حافتي الشريحة.

قم بتعبئة 600 ميكرولتر من محلول يحتوي على حجم واحد لواحد بعناية لمزيج حجمي 100٪ أسيتونيتريل و 50 ملليمولار بيكربونات الأمونيوم على إصبع ورق النشاف في الجزء السفلي من طبق بتري ، حتى يبدو الإصبع مبللا بشكل متساو. تعتبر سحب العينات أمرا بالغ الأهمية لأن سحب العينات غير الصحيح سيؤدي إلى إلغاء تحديد موقع المصفوفة والتشريحات السطحية مما يؤدي إلى تدمير المعلومات المكانية الموجودة في العينة. ضع النصف العلوي من حجرة البخار في النصف السفلي ، مع التأكد من محاذاة إصبع الورق وشريحة العينة بشكل مثالي ، وإغلاق الغرفة حول خط الاستواء بغشاء البارافين.

اترك العينة طوال الليل في حاضنة 37 درجة مئوية للسماح بالهضم الكامل. بمجرد هضمها ، اترك شريحة العينة على ميزان تحليلي مجهري مكون من خمسة أرقام. قم بتركيب الشريحة على إصبع التبريد لجهاز التسامي ، وقم بتثبيتها بشريط نحاسي بنفس الطريقة الموضحة لغرفة البخار.

ضع 300 ملليغرام من مصفوفة CHCA في طبق بتري زجاجي في قاع الغرفة ووزعها بالتساوي لتكوين طبقة رقيقة من بلورات المصفوفة. قم بتجميع التسامي. وقم بتأمين النصفين بمشبك حدوة الحصان.

قم بتعليق الوحدة المجمعة من 15 إلى 20 سم فوق حمام رملي ، مسخن مسبقا إلى 220 درجة مئوية ، عن طريق وضعها في حلقة معدنية متصلة بحامل معوجة. قم بتوصيل الغرفة بمصدر التفريغ ، وقم بإشراك الفراغ ، واتركه يستقر حتى حوالي 25 ملليتور لمدة خمس دقائق. قم بتعبئة إصبع التبريد إلى الأعلى بالثلج ، وأضف 50 مل من الماء.

اسمح للجهاز بالاستقرار لمدة خمس دقائق أخرى قبل المتابعة. اخفض الغرفة على سطح الحامل ، مع التأكد من أن الرمل يلامس تماما قاع الغرفة. اتركه لمدة 45 دقيقة لإنشاء طلاء مثالي يبلغ 0.22 ملليغرام لكل سنتيمتر مربع.

بعد 45 دقيقة ، قم بإزالة الغرفة من الحمام الرملي عن طريق رفع الحلقة المعدنية ، وتنفيس الغرفة. بمجرد التسامي ، قم بتركيب شريحة العينة داخل الجزء العلوي من غرفة البخار التي تم إنشاؤها مسبقا ، كما كان من قبل. قم بتعبئة 600 ميكرولتر من محلول يحتوي على حجم واحد لواحد بعناية لمزيج الحجم من الأسيتونيتريل وحمض ثلاثي فلورو أسيتيك في الماء على ورق النشاف في الجزء السفلي من طبق بتري لضمان طلاء متساو.

بعد ذلك ، قم بتجميع الغرفة ، مع التأكد من محاذاة علامة تبويب الورق وشريحة المجهر بشكل مثالي. اترك الغرفة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. امسح الشريحة ضوئيا في ماسح ضوئي مسطح لإنشاء صورة رقمية.

قم بتحميل العينة في مطياف الكتلة ، ثم قم بتحليلها باستخدام النظام الأساسي البرمجي المناسب. أخيرا ، قم بتحليل العينات كما هو موضح في بروتوكول النص. تظهر هنا عينة من الأنسجة المعالجة بشكل صحيح تم تصويرها على ارتفاع 50 ميكرون وتظهر بنية كلية جيدة وفرق واضح بين المادة البيضاء والمادة الرمادية.

ستظهر العينات التي تمت مقارنتها بنجاح تمايزا واضحا في مواقع الأنسجة المختلفة. هنا ، هناك منطقة واضحة من التنظيم الإضافي للببتيد ممثلة بنسبة الكتلة إلى الشحنة 1،085 في منطقة المادة البيضاء ، كما تمثلها المناطق البيضاء. على النقيض من ذلك ، تظهر هذه العينة المعدة بشكل غير صحيح مستوى واسع النطاق من إلغاء التمركز.

توضح أنماط الجزيئات الموجودة عبر اللوحات الثلاث بوضوح أنه لا يوجد تعريف واضح بين المناطق البيولوجية أو الاختلافات في وفرة الجزيئات المعروضة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فكرة جيدة حقا عن كيفية تحضير عيناتك الخاصة لتحليل تصوير الببتيد. مع الإجراء الصحيح ، يمكن تنفيذ هذه الطريقة في غضون ثماني ساعات على مدار يومين ، مما يسمح بخطوة الهضم طوال الليل.

أثناء إعداد هذه المنهجية ، من المهم توخي الحذر أثناء كل خطوة. أي ضرر مادي يحدث للأنسجة سوف يدمر المعلومات المكانية الموجودة في العينة. كانت لدينا فكرة هذه المنهجية عندما بدأنا لأول مرة تحقيقاتنا الفضائية IMS وأدركنا أنه لا توجد منهجيات نهائية أخرى تم نشرها.

مع تعديلات صغيرة ، يمكن تطبيق منهجيتنا على تحليل البروتينات والببتيدات والدهون والجزيئات الصغيرة الأخرى. بعد هذا الإجراء، يمكن بعد ذلك تطبيق تقنيات نسيجية أخرى مثل التألق المناعي وتلوين الهيماتوكسيلين واليوزين على عينتك من أجل الحصول على نقطة مرجعية لبيانات قياس الطيف الكتلي للتصوير. عند العمل مع المواد الكيميائية التي يحتمل أن تكون قابلة للانفجار ، مثل النيتروسليلوز السائل ، من المهم الحفاظ على إجراءات السلامة الصحيحة.

يعد تقليل أحجام العمل والتخلص من النفايات على الفور أمرا بالغ الأهمية.