تعبئة مقايسة^{2 +} من Ca المستندة إلى الأسفار حركية لتحديد يضع إلى جانب البروتين مستقبلات ز، والخصوم، والمغيرون Allosteric

الهدف العام من هذا الاختبار القائم على الخلايا هو تحديد وتوصيف الجزيئات القادرة على تحفيز أو تثبيط تعبئة الكالسيوم داخل الخلايا بوساطة مستقبلات بروتين G المقترنة بالبروتين. يمكن أن تكون هذه الطريقة اختبارا قيما لاكتشاف دواء المستقبلات المقترنة ببروتين G لأنه يمكن استخدامها للكشف عن الجزيئات التي تعدل أجسام الكالسيوم داخل الخلايا بوساطة المستقبلات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتحديد الجزيئات ذات الخصائص الناهضة أو العدائية في نفس الفحص.

قد يساعد هذا الاختبار في اكتشاف الأدوية المرشحة الجديدة التي تعمل على المستقبلات المقترنة ببروتين G ، مما يعد بأهداف علاجية تلعب دورا في العديد من الأمراض البشرية. في يوم مرور الخلية ، قم بتغطية كل بئر من صفيحة البوليسترين ذات الجدران السوداء المكونة من 96 بئر بقيعان شفافة مع 100 ميكرولتر من محلول الجيلاتين 0.1٪ واحتضان الألواح لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. أثناء تصلب الجيلاتين ، استخدم محلول التربسين EDTA لرفع الخلايا ذات الأهمية من قاع قارورة الثقافة ، وإعادة تعليق الخلايا في وسط نمو جديد في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر بمجرد انفصالها.

بعد العد ، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات في وسط نمو جديد إلى واحد في 10 إلى الخلايا الخامسة القابلة للحياة لكل تركيز مليلتر. عندما تصبح الألواح جاهزة ، تخلص من أي محلول جيلاتين زائد وجفف الألواح على مناديل المختبر. ثم اغسل الآبار ب 200 ميكرولتر من PBS واستبدل الغسيل ب 200 ميكرولتر من الخلايا لكل بئر لحضانة ليلية عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

في صباح اليوم التالي ، اضغط على اللوحة للتخلص من وسط النمو من الآبار وجفف اللوحة رأسا على عقب على منشفة ورقية. ثم قم بتسمية الخلايا في كل بئر ب 100 ميكرولتر من محلول صبغة التحميل لكل بئر واحتضان اللوحة لمدة 45 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. أثناء احتضان الخلايا ، أضف 75 ميكرولترا من CXCL12 لكل بئر إلى صفيحة الكيموكين و 50 ميكرولترا من المركب الذي يهم كل بئر من اللوحة المركبة.

بعد ذلك ، قم بتشغيل وحدة التبريد لقارئ اللوحة الفلورية متبوعة بقارئ اللوحة نفسه. بعد السماح للنظام ببضع دقائق للبدء ، افتح برنامج قارئ الألواح. لإعداد بروتوكول الفحص ، ضمن علامة التبويب الإعدادات ، حدد وضع القراءة والأطوال الموجية المناسبة للإثارة والانبعاث لصبغة التحميل.

حدد المزيج مع علامة تبويب سائل النقل للخلط التلقائي للمركبات في اللوحة المركبة. في علامة تبويب سائل النقل، اضبط 20 ميكرولترا من كل بئر من اللوحة المركبة ليتم نقلها إلى لوحة القياس وضع أطراف الماصة على 20 ميكرولترا تحت سطح السائل. اضبط سرعة الشفط على 50 ميكرولتر في الثانية وسرعة الاستغناء عن 25 ميكرولتر في الثانية وانقر فوق القراءة بسائل النقل.

خلال الفترة الأولى ، حدد 60 قراءة مع فاصل قراءة يبلغ ثانية واحدة مع تسجيل 10 قراءات قبل توزيع المركبات في لوحة القياس و 50 قراءة تكتمل بعد ذلك. اضبط الفاصل الزمني الثاني بفاصل زمني للقراءة يبلغ 30 ثانية و18 قراءة. حدد ثلاث غسلات طرفية للبروتوكول ، واضبط كل خطوة غسيل لتشمل سائل الغسيل المناسب ، ودورة غسيل واحدة ، وسرعة مضخة سريعة ، وخمس ضربات لكل غسلة.

استخدم وظيفة الماصة مؤقتا لتضمين إيقاف الماصة مؤقتا لمدة 300 ثانية واستخدم المزيج مع إعداد سائل النقل للسماح بالخلط التلقائي لمحلول CXCL12 داخل لوحة الكيموكين. في علامة تبويب سائل النقل اللاحقة ، اضبط 25 ميكرولترا من كل بئر من لوحة الكيموكين ليتم نقلها إلى لوحة القياس وضع الأطراف 20 ميكرولترا تحت سطح السائل. اضبط سرعة الشفط على 50 ميكرولتر في الثانية وسرعة الاستغناء على 25 ميكرولتر في الثانية.

استخدم زر القراءة مع سائل النقل لتعيين الفاصل الزمني الأول ليشمل 145 قراءة مع فاصل زمني للقراءة يبلغ ثانية واحدة. اضبط الفاصل الزمني الثاني على وقت فاصل قراءة مدته ست ثوان و20 قراءة. حدد ثلاث دورات أخرى لأطراف الغسيل.

ثم انقر فوق ضبط درجة حرارة المرحلة واضبط درجة حرارة الجهاز على 37 درجة مئوية. في نهاية حضانة صبغة التحميل ، تخلص من المخزن المؤقت من لوحة القياس وجفف اللوحة على مناديل المختبر. اغسل الخلايا ب 150 ميكرولتر لكل بئر من المخزن المؤقت للفحص ، واستبدل المخزن المؤقت ب 80 ميكرولترا من المخزن المؤقت للفحص بعد دقيقتين.

ضع لوحة القياس في موضع القراءة ، واللوحة المركبة في موضع المصدر الثاني ، ولوحة الكيموكين في المصدر ثلاثة ، وصندوق من الأطراف السوداء في موضع المصدر واحد. أغلق الجهاز وانقر فوق اختبار إشارة البروتوكول لتحديد وحدات الضوء النسبية للخلفية وتباين التألق على اللوحة. حدد إشارة الاختبار في النافذة المنبثقة.

إذا تم الحصول على قيم خلفية من 8 ، 000 إلى 10 ، 000 وحدة إضاءة نسبية ، فحدد تحديث وانقر فوق حفظ لحفظ البروتوكول الرئيسي. ثم اضغط على تشغيل لبدء الفحص. في هذا الرسم البياني ، يمكن ملاحظة زيادة تعتمد على الجرعة في التألق مرتبطة بالزيادة المعتمدة على الجرعة في إفراز الكالسيوم.

تسمح المستويات المتزايدة من التألق الناجم عن CXCL12 بتوليد منحنى استجابة الجرعة بناء على الفرق بين الحد الأدنى والحد الأقصى للاستجابة على خط الأساس بين القياس الأول بعد إضافة إضافة الكيموكين والقياس النهائي في البروتوكول. لم يتم استحضار أي استجابة متعلقة بالكالسيوم الفلوري بواسطة CXCL12 حتى عند التركيز العالي عند استخدام الخلايا التي تفتقر إلى مستقبلات الكيموكين الوظيفية المقابلة CXCR4 ، مما يدل على خصوصية المستقبل للقياس الذي تم استحضاره بواسطة CXCL12. يتمثل أحد التطبيقات الرئيسية لهذا الاختبار القائم على الخلايا في تحديد الجزيئات الصغيرة التي ، بعد الحضانة المسبقة ، تمنع الجرعة بشكل يعتمد على تعبئة الكالسيوم الناجم عن CXCL12 في الخلايا مقارنة بالمركبات غير النشطة التي لا تمنع الاستجابة.

لتحديد الفاعلية المثبطة للجزيئات الصغيرة ، يمكن إنشاء منحنى استجابة الجرعة للجزيئات المثبطة باستخدام الانحدار غير الخطي. يمكن استخدام هذا الاختبار لدراسة المستقبلات الأخرى المقترنة ببروتين G بدون تحسين إضافي أو مع الحد الأدنى من التحسين الإضافي وكذلك في هذه التجربة التي لوحظت فيها زيادة تعتمد على الجرعة في التألق عندما تم تحفيز مستقبلات كيميائية أخرى ، CCR5 ، باستخدام ناهض الكيموكين الطبيعي CCL5. بمجرد إتقانها ، يمكن استخدام هذه التقنية لدراسة العديد من المستقبلات الأخرى المقترنة ببروتين G التي تشير عبر تعبئة أيونات الكالسيوم داخل الخلايا عند تنشيط المستقبلات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام هذا الاختبار الخلوي لتحديد ناهضات ومضادات مستقبلات الكيموكينات CXCL4.