اكتشاف حانمه تشخيصية محددة الفيروس Zika

الهدف العام من هذه التجربة هو تحديد الببتيدات الخاصة بفيروس زيكا لاستخدامها في اختبار تشخيصي للكشف عن الأجسام المضادة لفيروس زيكا. هذا أمر بالغ الأهمية ، حيث يختفي الفيروس من الدم في غضون 10 أيام تقريبا ، بينما تستمر الأجسام المضادة لسنوات. تسمح لنا هذه الطريقة بتحديد المستضدات والحلقات باستخدام مصفوفة دقيقة من بروتين زيكا بأكمله لتحديد الببتيدات التي تلتقط الأجسام المضادة IgM أو IgG في عينة من المصل من فرد مصاب.

الميزة الرئيسية في الكشف عن كل من الأجسام المضادة المبكرة ، IgM ، والأجسام المضادة اللاحقة ، IgG ، هي تزويد الطبيب بجدول زمني للعدوى. وهذا مهم بشكل خاص عند النساء الحوامل. في حين أن هذا البروتوكول يوفر نظرة ثاقبة على سبب العدوى بفيروس زيكا ، إلا أنه يمكن تطبيقه على مسببات الأمراض الأخرى ، باستخدام مصفوفة دقيقة خاصة بهذا العامل الممرض إذا كان تسلسل البروتين معروفا.

تعامل مع الشريحة الزجاجية من الحواف باستخدام قفازات خالية من المسحوق. تبلغ أبعاد الشريحة الزجاجية 75.4 ملم × 25.0 ملم وسمكها 1 ملم. ضع الشريحة في درج الحضانة بحيث يكون سطح المصفوفة الدقيقة متجها لأعلى.

املأ حاملات الشرائح الفارغة بشرائح فارغة لمنع شريحة المصفوفة الدقيقة من الانكسار. ضع الجانب اللامع من الختم متجها لأسفل على السطح المطبوع بالمصفوفة الدقيقة. لضمان وضع جيد ، قم بتداخل فتحات المسامير في الختم ولوحة القاعدة.

ضع الجزء العلوي من الدرج على الختم لإنشاء حجرة مصفوفة دقيقة. قم بتأمين الشريحة في الدرج عن طريق شد مسامير الإبهام بالتساوي واحدة تلو الأخرى يدويا بنمط متناوب. ابدأ من أعلى اليسار وانتقل إلى أسفل اليمين.

ضع الغطاء على صينية الحضانة. يعد التعامل الدقيق مع المصفوفة الدقيقة أمرا ضروريا لتجنب خدش سطح المصفوفة الدقيقة. تتم إضافة المحاليل ثم إزالتها من زاوية غرفة المصفوفة الدقيقة.

تجفيف المصفوفة الدقيقة أمرا مهما أيضا لتوفير صورة مسح ضوئي جيدة. احتضان المصفوفة الدقيقة ب 2,000 ميكرولتر من المخزن المؤقت القياسي لكل صفيف دقيق لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على شاكر مداري عند 140 دورة في الدقيقة. قم بإزالة المخزن المؤقت القياسي عن طريق الشفط باستخدام ماصة من زاوية حجرة المصفوفة الدقيقة ، ثم قم بحظر المصفوفة الدقيقة بمخزن مؤقت مانع لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على شاكر مداري عند 140 دورة في الدقيقة.

قم بإزالة المخزن المؤقت للحجب عن طريق الشفط من زاوية حجرة المصفوفة الدقيقة باستخدام ماصة. أضف الجسم المضاد الثانوي المترافق IgM fluorochrome المضاد للإنسان المخفف 1: 5 ، 000 في مخزن التلوين إلى المصفوفة الدقيقة. ثم احتضان المصفوفة الدقيقة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام على شاكر مداري عند 140 دورة في الدقيقة.

استخدم ماصة لإزالة الجسم المضاد الثانوي عن طريق الشفط من زاوية غرفة المصفوفة الدقيقة. اغسل المصفوفة الدقيقة لمدة دقيقة واحدة باستخدام 2000 ميكرولتر مع مخزن مؤقت قياسي لكل مصفوفة دقيقة في درجة حرارة الغرفة على شاكر مداري عند 140 دورة في الدقيقة. قم بإزالة المخزن المؤقت القياسي باستخدام التقنية الموضحة وكرر الغسيل مرتين.

بعد ذلك ، اغمر الشريحة مرتين في 200 مل من عازلة الغمس المعدة حديثا. جفف المصفوفة الدقيقة بعناية لمدة دقيقة واحدة تقريبا عن طريق شفط السوائل الزائدة بعناية فائقة من أعلى إلى أسفل الشريحة دون لمس سطح الشريحة. قم بتحليل الشريحة في قارئ ماسح ضوئي للمصفوفات الدقيقة كما هو موضح لاحقا في هذا الفيديو.

قم بتعطيل عينة المصل عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم قم بالطرد المركزي للعينة عند 16،000 RCF لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. احتفظ بالعينة عند أربع درجات مئوية حتى الاستخدام.

ثم قم باحتضان المصفوفة الدقيقة مع مخزن التلوين المؤقت لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على شاكر مداري عند 140 دورة في الدقيقة. قم بإزالة المخزن المؤقت للتلطيخ عن طريق الشفط من زاوية حجرة المصفوفة الدقيقة باستخدام ماصة. قم بتخفيف عينة المصل ومخزن التلوين بدءا من التخفيف بنسبة 1: 1 ، 000.

احتضان العينة المخففة مع المصفوفة الدقيقة طوال الليل عند أربع درجات مئوية على شاكر مداري عند 140 دورة في الدقيقة. قم بإزالة عينة المصل المخففة باستخدام التقنية الموضحة. ثم اغسل المصفوفة الدقيقة ثلاث مرات كما كان من قبل.

تمييع الجسم المضاد الثانوي في مخزن تلطيخ. استخدم الجسم المضاد المترافق IgM fluorochrome المضاد للإنسان أو الجسم المضاد المترافق IgG fluorochrome المضاد للإنسان عند تخفيف 1: 5 ، 000 في مخزن التلوين. ثم امزج الجسم المضاد المسمى بالتحكم عند تخفيف 1: 1000 في مخزن مؤقت للتلطيخ مع الجسم المضاد الثانوي المخفف.

احتضن المصفوفة الدقيقة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام وعلى شاكر مداري عند 140 دورة في الدقيقة. قم بإزالة مزيج الأجسام المضادة الثانوية المخففة والملصقة عن طريق الشفط من زاوية حجرة المصفوفة الدقيقة باستخدام ماصة. ثم اغسل المصفوفة الدقيقة ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت القياسي.

كل غسلة لمدة دقيقة واحدة على شاكر مداري عند 140 دورة في الدقيقة. أخيرا ، قم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل من غرفة المصفوفة الدقيقة كما كان من قبل. لإجراء مسح المصفوفات الدقيقة ، اغمر الشريحة مرتين في 200 مل من مخزن الغمس المعد حديثا.

جفف المصفوفة الدقيقة لمدة دقيقة واحدة تقريبا عن طريق الشفط بعناية فائقة من أعلى إلى أسفل الشريحة دون لمس سطح الشريحة. امسح المصفوفة الدقيقة ضوئيا باتباع تعليمات الماسح الضوئي. ضع الشريحة على الماسحة الضوئية بحيث يكون السطح المطبوع متجها لأعلى.

قم بإنشاء مشروع جديد وحدد منطقة المسح. قم بتعيين معلمات الماسح الضوئي بدقة 21 ميكرون ، وشدة 7.0 لكل من القنوات 700 و 800 نانومتر ، وجودة مسح متوسطة ، وإزاحة 0.8. احصل على صورة رسم المسح الضوئي واحفظها بتنسيق ملف TIF بتدرج رمادي 16 بت.

لتحليل البيانات، افتح الصورة الأولية. ثم افتح ملف شبكة المصفوفة. قم بمحاذاة شبكة الصفيف مع صورة المسح الضوئي باستخدام الماوس أو مفاتيح أسهم لوحة المفاتيح بالكمبيوتر.

حدد تحديد التحديد الكمي في البرنامج المحدد ، والذي ينشئ ملف قراءة يحتوي على شدة الإشارة لكل بقعة وقيمة الخلفية وتسلسل الببتيد المقابل. أخيرا ، قم بتخزين المصفوفة الدقيقة محكمة الغلق في الظلام عند أربع درجات مئوية تحت النيتروجين الخالي من الأكسجين أو غاز الأرجون. تظهر هنا صورة التألق الخام لتلوين المصفوفة الدقيقة باستخدام IgG المضاد للإنسان بعد الحضانة بعينة مصل محددة من فيروس زيكا مخففة بنسبة 1:250.

ببتيدات التحكم HA تؤطر المصفوفة الدقيقة. يتم عرض الببتيدات التي تتفاعل بقوة مع IgG في لوحة التكبير. وبالمثل ، تظهر هنا صورة مضان خام لتلوين المصفوفة الدقيقة ب IgM المضاد للإنسان بعد الحضانة بعينة مصل محددة لفيروس زيكا مخففة بنسبة 1: 250.

مرة أخرى ، تقوم ببتيدات التحكم في HA بتأطير المصفوفة الدقيقة. يتم عرض الببتيدات التي تتفاعل بقوة مع IgM في لوحة التكبير/التصغير. يظهر هنا تسلسل إجماع حاتمة فيروس زيكا التمثيلي الذي يتفاعل مع IgM في ببتيدات عينة المصل المضيف.

يتم تمييز الببتيدات من تسلسل إجماع الحلقات باللون الأحمر ، ويتم تمييز الببتيد ذو أعلى شدة مضان بالخط العريض. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية معالجة مصفوفة الببتيد الدقيقة عالية الكثافة. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون 24 ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التعامل بعناية مع المصفوفة الدقيقة لتجنب خدش سطح المصفوفة الدقيقة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل ELISA أو اختبار ربط رنين البلازمون السطحي لتحديد ما إذا كانت الببتيدات المحددة مرتبطة على وجه التحديد بالأجسام المضادة لفيروس زيكا وليس بالأجسام المضادة الأخرى لفيروس Flavi. بعد تطويرها ، ستمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التشخيص لاكتشاف الببتيدات التشخيصية باستخدام عينات المصل واللعاب.

لا تنس أن العمل مع العوامل المعدية مثل فيروس زيكا يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل تعطيل عينة المصل بالحرارة والعمل في مرافق السلامة البيولوجية من المستوى 2 أثناء تنفيذ هذا الإجراء.