هيندبراين الماوس كنموذج لدراسة الخلايا الجنينية

الهدف العام من هذا الإجراء هو السماح بالتحليل النسيجي والعضو الكامل للدماغ الخلفي الجنيني للفأر أثناء النمو. تسمح هذه الطريقة بدراسة التطورات المتعلقة بتكوين الخلايا العصبية في الدماغ الخلفي لكائن حي نموذجي للثدييات. يعد الدماغ الخلفي النامي للفأر نموذجا ممتازا لدراسة نشاط النتوء العصبي نظرا لبنيتها المسطحة التي تسهل مراقبة أنماط تكوين الخلايا العصبية عبر العضو بأكمله.

ابدأ هذا الإجراء بالقتل الرحيم لأنثى فأرة حامل موقوتة باستخدام إجراء معتمد أخلاقيا في مرحلة الحمل المطلوبة. باستخدام مقص حاد ، افتح التجويف البريتوني واستئصال الرحم بعناية. ضع الرحم المستأصل الذي يحتوي على الأجنة في طبق بلاستيكي بحجم 60 ملم يحتوي على 20 مل من PBS المثلج.

قم بإجراء جميع عمليات التشريح الإضافية باستخدام مجهر تشريح. باستخدام ملقط صانع الساعات رقم خمسة ، قم بتمزيق جدار عضلة الرحم لكشف الأجنة. حرر كل جنين عن طريق قطع الحبل السري وإزالة كيس الصفار.

بعد نقل كل جنين إلى طبق بلاستيكي نظيف مع PBS المثلج ، استخدم ملقط صانع الساعات رقم 55 لقطع الرأس. اختياريا ، احتفظ بقطعة صغيرة من الأنسجة لعزل الحمض النووي الجيني والتنميط الجيني اللاحق. باستخدام ملقط Watchmaker رقم 55، قم باستئصال الأنسجة التي تحتوي على الدماغ الخلفي الموازي للظهارة العصبية الخلفية وأسفلها مباشرة لفصلها عن أنسجة الوجه والدماغ الأمامي.

ضع الدماغ الخلفي وأنسجة الرأس الذيلية ، الجانب الظهري لأعلى وحدد البطين الرابع المغطى بطبقة رقيقة من الأنسجة تعرف باسم لوحة السقف. اخترق لوحة السقف بعناية باستخدام ملقط صانع الساعات رقم 55 وقم بإزالة الأنسجة الزائدة بالملقط ، والتحرك بشكل مستقيم على طول خط الوسط فوق الدماغ الأوسط ثم ذيليا فوق الدماغ الخلفي والحبل الشوكي. يجب الآن الكشف عن الدماغ الخلفي في إعداد كتاب مفتوح.

لتحضير الدماغ الخلفي لوضع العلامات المناعية الكاملة ، استخدم ملقط Watchmaker رقم 55 لإزالة الرأس المتبقي من اللحمة المتوسطة وأي سحايا متصلة بجانب التقشير من الدماغ الخلفي. قم بإزالة أنسجة الدماغ الأوسط والحبل الشوكي لترك أنسجة الدماغ الخلفي فقط. لتحضير الدماغ الخلفي لتقطيع الاهتزاز والتبريد، استخدم ملقط Watchmaker رقم 55 لإزالة أنسجة الدماغ المتوسط والحبل الشوكي.

انقل الدماغ الخلفي من الطبق البلاستيكي إلى أنابيب مستديرة القاع بحجم ملليلترين باستخدام ماصة باستور. بعد شفط كل PBS ، قم بإصلاح الدماغ الخلفي لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية مع تحريك لطيف في 4٪ من الوزن المذاب حديثا لكل حجم فورمالديهايد المذاب في PBS. أخيرا ، اشطف الدماغ الخلفي ثلاث مرات باستخدام PBS.

إذا لزم الأمر ، أعد ترطيب الأدمغة الخلفية في أوهام الميثانول المتناقصة بشكل متسلسل في PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق عند كل تركيز. ثم انقل إلى الدماغ الخلفي إلى PBS. تخلل الدماغ الخلفي لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية في PBS الذي يحتوي على PBT مع تحريض لطيف.

ثم احتضان الدماغ الخلفي لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية في PBT الذي يحتوي على 10٪ مصل الماعز المعطل بالحرارة. بعد ذلك ، احتضان الأدمغة الخلفية طوال الليل كما كان من قبل في PBT الذي يحتوي على 1٪ مصل معطل للحرارة والأجسام المضادة الأولية. في اليوم التالي ، اغسل الدماغ الخلفي عند أربع درجات مئوية باستخدام PBT لمدة ساعة واحدة لكل منهما.

بعد الغسيل ، احتضان الدماغ الخلفي طوال الليل عند أربع درجات مئوية في PBT الذي يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور المناسبة المستهدفة ضد الأجسام المضادة الأولية المستخدمة. احتفظ بالدماغ الخلفي في الظلام من هذه النقطة فصاعدا لحماية الفلوروفورات من التبييض الضوئي. بعد الغسيل كما كان من قبل باستخدام PBT ، قم بإصلاح الدماغ الخلفي بعد 4٪ فورمالديهايد في PBS لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للحفاظ على ارتباط الأجسام المضادة على المدى الطويل.

في هذه الأثناء ، قم بتغطية شريحة المجهر الزجاجي بطبقتين من الشريط الكهربائي الأسود واستخرج مربعا صغيرا من الشريط متعدد الطبقات لإنشاء جيب كبير بما يكفي لحمل الدماغ الخلفي. بعد شطف الدماغ الخلفي لفترة وجيزة مرتين في PBS ، انقله إلى الجيب باستخدام ماصة باستور. قم بإزالة السائل الزائد وأضف كاشفا مناسبا مضادا للبهتان إلى الجيب.

ثم قم بتغطية الدماغ الخلفي ببطء بغطاء زجاجي لتجنب محاصرة فقاعات الهواء تحت الغطاء. أغلق الغطاء وألصقه على الشريحة بطبقة رقيقة من طلاء الأظافر. قم بتخزين الشريحة عند أربع درجات مئوية في الظلام حتى الحصول على الصورة.

قم بتضمين الأدمغة الخلفية في الاغاروز المنصهر بنسبة 3٪ من الوزن لكل حجم محضر في الماء المقطر. ينقل القطع أقسام الدماغ الخلفي إلى سمك 70 ميكرون باستخدام اهتزاز. انقل كل قسم مقطوع حديثا بفرشاة رسم إلى بئر واحد من طبق 24 بئرا يحتوي على PBS مثلج.

بعد تسمية الأقسام العائمة كما هو مفصل في بروتوكول النص ، اغسلها لفترة وجيزة في PBS. انقل الأقسام العائمة بعناية إلى شريحة مجهر زجاجي باستخدام فرشاة الرسم. امسح PBS الزائد حول القسم باستخدام ورق أو مناديل ورقية.

ليست الأقسام التي تستخدم 80٪ من الجلسرين في PBS. وقم بتغطيتها ببطء بغطاء زجاجي لتجنب احتجاز فقاعات الهواء. قم بتخزين الشريحة عند أربع درجات مئوية في الظلام حتى الحصول على الصورة.

احتضان الدماغ الخلفي بوزن 30٪ لكل حجم سكروز في PBS عند أربع درجات مئوية لحماية الدماغ الخلفي بالتبريد قبل التجميد. اغمر الدماغ الخلفي في مركب درجة حرارة القطع البصري أو OCT. بعد ذلك ، قم بتجميدها بسرعة عن طريق نقل القوالب التي تحتوي على الأمطار الخلفية إلى الأيزوبنتان المبرد إلى ما بين 40 و 50 درجة مئوية على الجليد الجاف.

بعد ذلك ، قم بقص أقسام الدماغ الخلفي بسمك 10 ميكرون باستخدام ناظم البرد. انقل أقسام الدماغ الخلفي إلى شرائح مجهر لاصقة إلكتروستاتيكي. احتضن الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة لتجفيف الأقسام على الشرائح.

ثم اغسل أقسام التبريد باستخدام PBS لإذابة OCT. ضع علامة على حاجز كاره للماء حول أقسام التبريد باستخدام قلم PAP. قم بتصوير العينات باستخدام مجهر المسح الضوئي بالليزر Epi-fluorescent أو متحد البؤر المزود بعدسات مناسبة للشرائح المثبتة على الوسائط المائية بالإضافة إلى مرشحات بصرية مناسبة للفلوروفورات المستخدمة في وضع العلامات المناعية.

لتصوير الدماغ الخلفي بالكامل أو قسم الدماغ الخلفي ، استخدم عدسة للتكبير 10 مرات. لتصور مناطق الدماغ الخلفي للقياس الكمي ، استخدم تكبير 40 مرة. ولتصور الخلايا الفردية ، استخدم عدسة بتكبير 63 مرة.

تظهر هنا نتائج تمثيلية من الأدمغة الخلفية المناعية الكاملة لمراقبة انقسام الخلايا السلفية العصبية في المنطقة البطينية. تم الحصول على هذه الصور باستخدام علامة الانقسامية فوسفو هيستون H3 في مراحل متتالية من التطور. تم تصنيف أقسام الاهتزاز المستعرضة بعد نبضة مدتها ساعة واحدة من EdU لتسليط الضوء على الخلايا السلفية العصبية للدماغ الخلفي التي تخضع للهجرة النووية بين الحركية بالإضافة إلى الخلايا الإيجابية للفوسفو هيستون H3 الانقسامية على سطح البطين.

يمكن تحديد النسبة الإجمالية للخلايا السلفية العصبية ذاتية التجديد عن طريق حساب النسبة المئوية للخلايا الموجبة المزدوجة Ki67 BrdU باللون الأصفر بين جميع الخلايا الإيجابية BrdU باللونين الأحمر والأصفر في أقسام التبريد العرضية للدماغ الخلفي من الأجنة بعد يوم واحد من إعطاء BrdU. يمكن أيضا تصنيف أقسام اهتزاز الدماغ الخلفي بجسم مضاد لبروتين الخيوط الوسيط Nestin المعروف أيضا باسم RC-2 لتصور نهاية الخلية السلفية العصبية والنتوءات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل مستحضر التثبيت المسطح أو أقسام الأنسجة المستعرضة من الدماغ الخلفي.

بمجرد إتقان ، يمكن تشريح ما يصل إلى 10 أدمغة خلفية في أقل من ساعة واحدة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم استخدام PBS البارد المثلج إذا كنت تتعرف أولا على التشريح الدقيق للدماغ الخلفي لأن هذا يسهل الانفصال عن السحايا ، بالإضافة إلى ضمان الحفاظ على الأنسجة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل قياس التدفق الخلوي على معلقات الخلية المفردة في الدماغ الخلفي لفصل الأسلاف العصبية عن أنواع الخلايا الأخرى.

إنشاء هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأعصاب التنموي لاستكشاف آليات تكوين الخلايا العصبية للثدييات باستخدام الدماغ الخلفي كبديل لنماذج الحبل الشوكي والدماغ الأمامي المستخدمة تقليديا. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة على تكوين الخلايا العصبية للدماغ الخلفي للثدييات ولكن يمكن أيضا تطبيقها على الفقاريات النامية الأخرى نظرا لدرجة التشابه الهيكلي والجزيئي بين الأنواع. قد تساعد هذه التقنية في اكتشاف آليات جديدة تتحكم في تكوين الخلايا العصبية وتساعد في تحديد ما إذا كانت تلك التي تم تحديدها في مكان آخر في المحور قد تم تلخيصها في هذا الجزء من دماغ الفقاريات.