Name: هيندبراين الماوس كنموذج لدراسة الخلايا الجنينية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: استكشف تحليل الدماغ الخلفي الجنيني للفأر لدراسة تكوين الخلايا العصبية في نمو الأعصاب. يوضح هذا البروتوكول كيفية عزل الأنسجة وإعدادها للتصوير المناعي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ونشكر تشانتزارا فاسيليكي للاضطلاع بتوقيت ماتينجس وموظفي "وحدة الموارد البيولوجية" في "معهد UCL لطب العيون" لتربية الماوس. وأيد هذه الدراسة "ويلكوم ترست المحقق جائزة" 095623/Z/11/Z إلى الجمهورية التشيكية.

<ol><li>Wilsch-Brauninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortex+expansion+in+development+and+evolution+-+from+cell+biology+to+single+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neocortex expansion in development and evolution - from cell biology to single genes.</a> Curr Opin Neurobiol. 39, 122-132 (2016).</li>
<li>Gregg, C., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNTF%2FLIF%2Fgp130+receptor+complex+signaling+maintains+a+VZ+precursor+differentiation+gradient+in+the+developing+ventral+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">CNTF/LIF/gp130 receptor complex signaling maintains a VZ precursor differentiation gradient in the developing ventral forebrain.</a> Development. 132 (3), 565-578 (2005).</li>
<li>Kwon, G. S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eomes%3A%3AGFP-a+tool+for+live+imaging+cells+of+the+trophoblast%2C+primitive+streak%2C+and+telencephalon+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Eomes::GFP-a tool for live imaging cells of the trophoblast, primitive streak, and telencephalon in the mouse embryo.</a> Genesis. 45 (4), 208-217 (2007).</li>
<li>Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hox+Genes+and+the+Hindbrain%3A+A+Study+in+Segments%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Hox Genes and the Hindbrain: A Study in Segments.</a> Curr Top Dev Biol. 116, 581-596 (2016).</li>
<li>Guthrie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+and+axon+guidance+of+cranial+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Patterning and axon guidance of cranial motor neurons.</a> Nat Rev Neurosci. 8 (11), 859-871 (2007).</li>
<li>Fantin, A., Vieira, J. M., Plein, A., Maden, C. H., Ruhrberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+mouse+hindbrain+as+a+qualitative+and+quantitative+model+for+studying+the+molecular+and+cellular+mechanisms+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The embryonic mouse hindbrain as a qualitative and quantitative model for studying the molecular and cellular mechanisms of angiogenesis.</a> Nat Protoc. 8 (2), 418-429 (2013).</li>
<li>Terriente, J., Gerety, S. S., Watanabe-Asaka, T., Gonzalez-Quevedo, R., Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+from+hindbrain+boundaries+regulates+neuronal+clustering+that+patterns+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Signalling from hindbrain boundaries regulates neuronal clustering that patterns neurogenesis.</a> Development. 139 (16), 2978-2987 (2012).</li>
<li>Coolen, M., Thieffry, D., Drivenes, O., Becker, T. S., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-9+controls+the+timing+of+neurogenesis+through+the+direct+inhibition+of+antagonistic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">miR-9 controls the timing of neurogenesis through the direct inhibition of antagonistic factors.</a> Dev Cell. 22 (5), 1052-1064 (2012).</li>
<li>Dias, J. M., Alekseenko, Z., Applequist, J. M., Ericson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tgfbeta+signaling+regulates+temporal+neurogenesis+and+potency+of+neural+stem+cells+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Tgfbeta signaling regulates temporal neurogenesis and potency of neural stem cells in the CNS.</a> Neuron. 84 (5), 927-939 (2014).</li>
<li>Jacob, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoid+acid+specifies+neuronal+identity+through+graded+expression+of+Ascl1%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinoid acid specifies neuronal identity through graded expression of Ascl1.</a> Curr Biol. 23 (5), 412-418 (2013).</li>
<li>Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+derive+from+the+more+apical+daughter+in+asymmetric+divisions+in+the+zebrafish+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube.</a> Nat Neurosci. 13 (6), 673-679 (2010).</li>
<li>Peretz, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+role+of+hindbrain+boundaries+as+pools+of+neural+stem%2Fprogenitor+cells+regulated+by+Sox2%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">A new role of hindbrain boundaries as pools of neural stem/progenitor cells regulated by Sox2.</a> BMC Biol. 14, 57(2016).</li>
<li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+zebrafish+embryonic+brain+by+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy.</a> J Vis Exp. (26), (2009).</li>
<li>Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+manipulate+the+fate+of+single+neural+stem+cells+in+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue.</a> Nat Neurosci. 15 (2), 329-337 (2011).</li>
<li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Hutton, S. R., Pevny, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX2+expression+levels+distinguish+between+neural+progenitor+populations+of+the+developing+dorsal+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">SOX2 expression levels distinguish between neural progenitor populations of the developing dorsal telencephalon.</a> Dev Biol. 352 (1), 40-47 (2011).</li>
<li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+embryonic+mouse+neural+stem+cell+culture+using+the+neurosphere+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay.</a> J Vis Exp. (47), (2011).</li>
<li>Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis+in+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Mitosis in the neural tube.</a> The Journal of Comparative Neurology. 62 (2), 377-405 (1935).</li>
<li>Sessa, A., Mao, C. A., Hadjantonakis, A. K., Klein, W. H., Broccoli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tbr2+directs+conversion+of+radial+glia+into+basal+precursors+and+guides+neuronal+amplification+by+indirect+neurogenesis+in+the+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Tbr2 directs conversion of radial glia into basal precursors and guides neuronal amplification by indirect neurogenesis in the developing neocortex.</a> Neuron. 60 (1), 56-69 (2008).</li>
<li>Pilz, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+progenitors+in+the+mammalian+telencephalon+includes+a+new+radial+glial+cell+type%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type.</a> Nat Commun. 4, 2125(2013).</li>
<li>Fantin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+macrophages+act+as+cellular+chaperones+for+vascular+anastomosis+downstream+of+VEGF-mediated+endothelial+tip+cell+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Tissue macrophages act as cellular chaperones for vascular anastomosis downstream of VEGF-mediated endothelial tip cell induction.</a> Blood. 116 (5), 829-840 (2010).</li>
<li>Kayam, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+Pax6+in+the+segmental+organization+of+the+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A novel role for Pax6 in the segmental organization of the hindbrain.</a> Development. 140 (10), 2190-2202 (2013).</li>
<li>Tata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+embryonic+neurogenesis+by+germinal+zone+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Regulation of embryonic neurogenesis by germinal zone vasculature.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), 13414-13419 (2016).</li>
</ol>

لدى أي من أصحاب المصالح المتنافسة أو المصالح المتضاربة.

هذا البروتوكول يصف كيفية استخدام hindbrain الجنينية الماوس كنموذج لدراسة آليات الخلايا التنموية. استخدام مجموعة متنوعة من أساليب إيمونولابيلينج مختلفة، يمكن تصور hindbrain الشخصيات وعددها كمياً في أقسام الأنسجة أو عبر جهاز ووليمونتس. ويضمن سهولة التشريح والتشريح شقة أن يمكن تصويرها في هيندبرين في إعداد 'كتاب مفتوح' لجمع المعلومات عن أنماط الخلايا على مستوى الجهاز.
نعرض كذلك أن مورفولوجيا المجلس الوطني والمتصلة بدوره الخلية لمجلس الشعب لتحديد المواقع يمكن تصور على سهولة في العائمة-أو كريوسيكشنز هيندبرين. يمكن أن تستغل كل السلوكيات لتعريف السكان الجدد السلف، كما قد أجريت سابقا في الثدييات تيلينسيفالون20. على سبيل المثال، أوائل تشكيل نيوروبيثيليا Sox2+ وإطلاق شعاعي قمي Pax6+ موجودة في21،هيندبرين22، ولكن hindbrain يفتقر إلى فروعه القاعدية Tbr2+ 3 .
البروتوكول هو موضح هنا أيضا يمكن تكييفها لمراقبة سلوك الفئات السكانية الفرعية للمجلس الوطني محددة بوصفها الفلورسنت للتصوير الحي و/أو تتبع النسب في الأنسجة الثابتة. يمكن أن يتحقق هذا، على سبيل المثال، بدراسة هيندبراينس من الفئران تحمل التحوير Sox1-iCreERT2 تاموكسيفين إيندوسيبلي و مراسل Rosa26تدتوماتو 23.
بالإضافة إلى تعزيز المعرفة بالخلايا مورين، الذين يدرسون في هيندبرين قد توضيح الآليات العصبية ذات الصلة على نطاق واسع التي تمت مشاركتها عبر الأنواع، لأنه هيندبرين وهي منطقة الدماغ العالية مصانة التي من المتوقع أن يكون أكثر مماثلة بين الأنواع الفقارية مما forebrain.
كما hindbrain الخلايا يحدث خلال إطار زمني أقصر نسبيا من الخلايا فوريبرين23، من المهم النظر في الحاجة إلى مقارنة كافية نظموا الأجنة. تبعاً لذلك، هو تجنب التحيز التجريبية عد وتسجيل عدد أزواج سميط في جنين قبل عزل به هيندبرين. الأنسجة هيندبراين نفسها لا يزال هشا وينبغي لذلك أن تعالج الملقط بعناية عند فصل الأنسجة هيندبراين عن ميسينتشيمي الرأس والسحايا؛ زوجين من 'تشغيل الممارسة' قد يكون ولذا من المستصوب قبل محاولة تشريح الأجنة قيمة. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن تنقل هيندبرينس من أنبوب واحد إلى آخر باستخدام ماصة باستور تحمل على نطاق بدلاً من الملقط لتجنب الأضرار (يمكن توسيع فتح ماصة بقطع رأس مع مقص نظيف). وأخيراً، على الرغم من غير المألوف، مدى إدماج إيدو/بردو الشخصيات S-المرحلة قد يكون المتغير، خاصة خلال نبضات قصيرة (أي، ح 1). لتحسين وضع العلامات، ضمان أن إيدو/بردو هو حل بشكل صحيح قبل تحميل الحل في المحاقن وحقن بعناية في التجويف الصفاقى. سوف يؤدي إلى فقدان أو محاصرة الحل إيدو/بردو حقن الفقراء، مثل تلك التي تحت الجلد عن طريق الصدفة، ومنعه من الدخول إلى الدورة الدموية.

أثناء تطوير الثدييات الجنينية، تقسيم الشخصيات في البطين (VZ) ومناطق (SVZ) سوبفينتريكولار نيوروبيثيليوم الآخذة في التوسع لتوليد الخلايا العصبية الجديدة في عملية تسمى 'الخلايا'. جيل جديد من الخلايا العصبية وسلائفها نواب تم التحقيق على نطاق واسع في forebrain1، بينما يعرف عن هذه العملية في مناطق أخرى.
Forebrain هو بنية معقدة ومعقد مطوية التي يتم دراستها إلى حد كبير مع أساليب نسيجية بعد تقطيع الأنسجة، مما يجعل فهم أنماط الخلايا عبر الجهاز كله تحديا. وبالإضافة إلى ذلك، دراسات للخلايا forebrain ليست التنبؤية بالضرورة سلوك العصبية في مناطق أخرى في الدماغ أو في الحبل الشوكي. على سبيل المثال، إشارات العظة قد الحصول على ردود متباينة عبر مناطق متميزة في الجهاز العصبي المركزي، كما لوحظ في حالة عامل نيوروتروفيك الهدبية واللوكيميا المثبطة، التي تشجع التجديد الذاتي للشخصيات في الأفقي ganglionic فضيلة، ولكن محرك الأقراص التفريق بين النخاع الشوكي المتكفل2. وعلاوة على ذلك، توجد فئة فرعية من الشخصيات التي ملء forebrain النامية ويسهم إلى حد كبير إلى التوسع في قشرة الدماغ1 من3هيندبرين والحبل الشوكي. عكسيا، فمن المتصور أن الحبل الشوكي و hindbrain تحتوي على أنواع فرعية للمجلس الوطني البديلة ليست موجودة في القشرة.
Hindbrain الجنين الماوس هو منطقة أقدم التطوري الدماغ الثدييات وينشئ المخيخ وجذع الدماغ. وعلى الرغم من المحافظة عليه عبر الأنواع، المعروف قليل نسبيا حول الخلايا هيندبراين، بما في ذلك الأنواع الفرعية لمجلس الشعب أو تنظيمها. معظم البحوث هيندبرين في الماوس ركز على عملية تجزئة الأنسجة، يقودها Hox الجينات4، والزخرفة من الخلايا العصبية الانقسامية بعد5. وبالإضافة إلى ذلك، قد استخدمت في هيندبرين كنموذج لدراسة آليات إنمائية تولد الأوعية6.
على النقيض من hindbrain الماوس، استخدمت على نطاق واسع hindbrain الزرد متابعة نواب التمايز والنسب التدرج في كائن نموذج فقاريات (مثلاً،،من78). كما استخدمت hindbrain الفرخ لدراسة الخلايا أثناء تطوير الفقارية (مثلاً،،من910). مماثلة إلى hindbrain الزرد11، hindbrain فرخ يمكن أن يعيش تصويرها لدراسة سلوك نواب واللائحة على مدى الساعة12. المراقبة طولية شبيهة بتصوير مباشر من غير الممكن حاليا في الكائنات الثديية، نظراً لأنها تضع في الرحم. وعلاوة على ذلك، تستهدف التلاعب من خلال تقنيات مثل يمكن تطبيقها انهانسر سهولة الزرد الشرانق الأجنة أو الفرخ الأجنة في ovo (مثلاً،13)، ولكن هذه التقنيات أيضا أكثر صعوبة في الرحم.
ومع ذلك، هيندبراين الجنين الماوس رائع مناسبة لتحديد الآليات الجزيئية والخلوية التي تنظم الخلايا. أولاً، تحليل hindbrain الماوس سيتم، في كثير من الحالات، توفر معلومات أكثر صلة بتطورات البشر من التي تم الحصول عليها من خلال دراسة الفقاريات أقل. وعلاوة على ذلك، تتوفر عدد ضخم من السلالات المعدلة وراثيا الماوس أنه يمكن أما استخدام لمصير تعيين مورين الشخصيات أو لتغيير آليات تنظيمية مع الآليلات الطور التأسيسي أو الشرطي الجينات ذات الصلة. وأخيراً، مؤخرا وقد ثبت أن microinjection hindbrain البطين موروث السابقين فيفو يسمح على الأقل دراسة موجزة ل hindbrain نواب حركية14. ومع ذلك، في الوقت الحاضر، هو يعرف إلا القليل جداً عن المنظمة الزمانية المكانية والسلوك من الشخصيات هيندبرين في سياق جهاز كله.
هنا، علينا أن نظهر طريقة بسيطة وسريعة لاستخدام في هيندبرين كنموذج قوية لتحليل سلوك نواب الثدييات في أقسام الأنسجة والاستعدادات ووليماونت. نقدم كذلك البروتوكولات ﻻستخدام إيمونولابيلينج لدراسة معلمات مختلفة من الخلايا وعملية hindbrain عينات أخرى للتطبيقات الجزيئية المصب مثل الكمية عكس المنتسخة (قرة)-بكر.

<table><tbody><tr><td>أنبوب كاشف دائري القاع ، 2.0 مل (قفل آمن)</td> <td>VWR</td><td>211-2120</td><td>متوفر أيضا من الموردين التجاريين الآخرين</td></tr><tr><td>طبق زراعة الخلايا البلاستيكية ، 150288</td><td>Thermo Fisher</td><td></td> 60 <td>مم متوفر أيضا من الموردين التجاريين</td></tr><tr><td>الآخرين ألواح زراعة الخلايا ،</td><td>150628</td><td>Thermo Fisher</td> 12 <td>بئر متوفر أيضا من الموردين التجاريين</td></tr><tr><td>الآخرين ماصات باستور</td><td>كوبان</td><td>200C</td><td>متوفر أيضا من الموردين التجاريين الآخرين</td></tr><tr><td>ملقط Dumont Watchmaker ، رقم 5</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Watchmaker ، رقم 55</td><td>FST</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>29G إبرة / حقنة</td><td>BD</td><td>BD Micro-Fine + 1 مل</td><td></td></tr><tr><td>الأجسام المضادة الأولية المضادة للفوسفو هيستون H3</td><td>Millipore</td><td>06-570</td><td>الماعز ، التخفيف 1: 400</td></tr><tr><td>الجسم المضاد الأولي المضاد ل BrdU</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>الفأر ، التخفيف 1: 400</td></tr><tr><td>الأجسام المضادة الأولية Anti-Ki67</td><td>BD Biosciences</td><td>550609</td><td>الماوس ، التخفيف 1: 400</td></tr><tr><td>الأجسام المضادة الأولية المضادة ل RC2</td><td>الدراسات التنموية الورم الهجين بنك</td><td>RC2</td><td>الفأر (IgM) ، التخفيف 1: 400</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 المترافق الماعز المضاد للأرانب الجسم المضاد الثانوي</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11029</td><td>التخفيف 1: 200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 المترافق الماعز المضاد للأرانب الجسم المضاد الثانوي</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11037</td><td>التخفيف 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 المترافق الماعز المضاد للفأر IgM الجسم المضاد الثانوي</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21042</td><td>التخفيف 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 المترافق الماعز المضاد للفأر الجسم المضاد الثانوي</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td>التخفيف 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 المترافق الماعز المضاد للفئران الجسم المضاد الثانوي</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11007</td><td>التخفيف 1: 200</td></tr><tr><td>4'، 6-Diamidino-2-Phenylindole، ثنائي هيدروكلوريد (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>استخدام في 10 & mu; جم لكل مل</td></tr><tr><td>5-إيثينيل-2'-ديوكسيوريدين (EdU)</td><td>سيجما</td><td>900584</td><td></td></tr><tr><td>5-برومو-2 حاد ؛ -ديوكسيوريدين (BrdU)</td> <td>سيجما</td><td>B5002</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>C10086</td><td></td></tr><tr><td>مصل الماعز المعطل حراريا</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>مصل الأبقار الألبومين</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>DAKO بروتين بلوك مصل خال</td><td>من Agilent</td><td>X0909</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>متاح أيضا من الموردين التجاريين</td></tr><tr><td>الآخرين عازلة الفوسفات محلول ملحي</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td>متاح أيضا من الموردين التجاريين الآخرين</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>متاح أيضا من الموردين التجاريين الآخرين</td></tr><tr><td>الصوديوم رباعي البورات</td><td>سيجما</td><td>B9876</td><td>متاح أيضا من الموردين التجاريين</td></tr><tr><td>الآخرين السكروز</td><td>سيجما</td><td>S0389</td><td>متاح أيضا من الموردين التجاريين</td></tr><tr><td>الآخرين Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td>متاح أيضا من الموردين التجاريين الآخرين</td></tr> مانع <tr><td>سائل القلم Super PAP</td><td>Ted Pella، Inc.</td><td>22309</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade Antifade Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>S-2828</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>10337700</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Millipore</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Scigen</td><td>4583</td><td>متاح أيضا من الموردين التجاريين الآخرين</td></tr><tr><td>Isopentane</td><td>Sigma</td><td>M32631</td><td>متاح أيضا من الموردين التجاريين الآخرين</td></tr><tr><td>الميثانول</td><td>ثيرمو فيشر</td><td>10675112</td><td>متاح أيضا من الموردين التجاريين</td></tr><tr><td>الآخرين حمض الهيدروكلوريك</td><td>Thermo Fisher</td><td>10316380</td><td>متاح أيضا من الموردين التجاريين الآخرين</td></tr> شرائح <tr><td>المجهر</td><td>VWR</td><td>631-0912</td><td></td></tr> شرائح <tr><td>مجهر Superfrost</td><td>VWR</td><td>631-0108</td><td></td></tr> ميزان <tr><td>الحرارة</td><td>VWR</td><td>620-0858</td><td></td></tr><tr><td>غطاء زجاجي</td><td></td><td>VWR 631-0137</td><td></td></tr><tr><td>مجهر ستيريو ، Leica MZ16</td><td>Leica</td><td>غير قابل للتطبيق</td><td></td></tr><tr><td>مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر &nbsp ؛ LSM710</td><td>Zeiss</td><td>غير قابل للتطبيق</td><td></td></tr></tbody></table>

هيندبراين الماوس كنموذج لدراسة الخلايا الجنينية

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

Forebrain الجنين الماوس هو نظام العاملين الأكثر شيوعاً لدراسة الخلايا الثديية أثناء التطوير. ومع ذلك، نيوروبيثيليوم forebrain مطوية عالية غير قابلة لتحليل ووليماونت دراسة أنماط الخلايا على مستوى الجهاز. وعلاوة على ذلك، تحديد آليات الخلايا forebrain ليست بالضرورة التنبؤية للخلايا في أجزاء أخرى من الدماغ؛ على سبيل المثال، بسبب وجود أنواع فرعية محددة forebrain السلف. هيندبرين الماوس يوفر نموذج بديل لدراسة الخلايا الجنينية التي قابلة للتحليل ووليماونت، فضلا عن أقسام الأنسجة لمراقبة توزيع الزمانية المكانية وسلوك موروث العصبية. وعلاوة على ذلك، هو تشريح بسهولة للتطبيقات المتلقين للمعلومات الأخرى، مثل تحليل العزلة أو البيولوجيا الجزيئية في خلية. كما يمكن تحليل hindbrain الماوس سهولة في عدد كبير من خلية نسب مراسل وسلالات متحولة الماوس التي أصبحت متاحة، ويقدم نموذجا قويا لدراسة الآليات الجزيئية والخلوية للخلايا التنموية في الثدييات الكائن الحي. نقدم هنا، طريقة بسيطة وسريعة لاستخدام hindbrain الجنين الماوس لتحليل سلوك الخلية (مجلس الشعب) السلف العصبية الثدييات في أقسام الأنسجة والاستعدادات ووليماونت.

ويوضح هذا القسم أمثلة على النتائج التي يمكن الحصول عليها عند دراسة الخلايا في هيندبراين الجنينية الماوس من خلال تحليل المقطع ووليمونت والأنسجة.
نظهر أن إيمونولابيلينج ووليماونت من هيندبرين ميكروديسيكتيد مع جسم مضاد يتصور pHH3 ماركر الانقسامية تقسيم الشخصيات في VZ (الشكل 2B – د). نعرض pHH3+ الشخصيات في تكبير عالية لتسليط الضوء على مراحل مختلفة من الانقسام (الشكل 2). ونحن قد يتضح أن هذا الأسلوب وضع العلامات المناسبة التي يتعين القيام بها عبر عدة مراحل متتالية من التنمية هيندبرين مراقبة مسار الوقت الانقسام الوطني في هذا الجهاز (الشكل 2D).
نظهر أن التصوير إيمونولابيليد عرضية فيبرتوم أبواب hindbrain ح 1 بعد حقن إيدو، يتصور اتجاه الانقسام والشخصيات الانقسامية (الشكل 3B)، نمط الهجرة النووية بسيودوستراتيفيد، إينتيركينيتيك من ركوب الدراجات موروث18 (الشكل 3، د)، والهيكل العام VZ (الشكل 3B – د). لاحظ أن pHH3 الانقسامية+ الشخصيات موجودة فقط في سطح البطين وليس أكثر بأسالي (الشكل 3)، التي يتناقض نمط الشخصيات أكثر التزاما في forebrain19شعبة القاعدية.
نحن أيضا لتوضيح كيف يمكن المسمى ركوب الدراجات الشخصيات وذرياتهم متباينة مع بردو أو إيدو لتقييم تطور نسب نواب (الشكل 4). إيمونولابيلينج كريوسيكتيونس عرضية من الماوس hindbrain يوم 1 بعد حقن بردو بردو و Ki67يوضح العدد وتحديد المواقع للدراجات الشخصيات في نيوروبيثيليوم (الشكل 4 أ، ب)، حيث أن عدد الذاتي تجديد الشخصيات يمكن تعريفها بواسطة حساب النسبة مئوية Ki67 الخلايا بردو+ + بين جميع الخلايا بردو+ (الشكل 4 أ، ج).
أخيرا، نحن إظهار مثال على إيمونولابيلينج أقسام فيبرتوم hindbrain RC2، مستضد في الشعيرة المتوسطة الخاصة بالعصبية نيستين، وضع تصور لنواب الشعب الصيني اندفيت (الشكل 5B) والعمليات (الشكل 5). أقسام فيبرتوم، بدلاً من كريوسيكتيونس رقيقة، السماح بالمراقبة المحسنة الشخصيات العالية تشعبت وأيضا الهيكل العام نيوروبيثيليال.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig1.jpg"> الشكل 1 : الخطوات الرئيسية في التشريح هيندبرين من جنين الفأر e11.5. (أ – د) تصوير ميكروديسيكتيون هيندبراين التخطيطي. (أ) الأنسجة الرأس والذيلية تتم إزالتها من قبل قطع على طول أحمر منقط. (ب) لوحة سقف اخترقت وثم مزقت بعيداً في اتجاهات كل من روسترال ووالذيليه على طول خط الوسط (الخطوط الحمراء الرأسية) ومن ثم أفقياً للكشف عن نيوروبيثيليوم هيندبرين. (ج) نيوروبيثيليوم هو تبتعد عن السحايا بعد إدراج الملقط بين كل الهياكل، وتتم إزالة الأنسجة midbrain والحبل الشوكي بقطع الأنسجة بالملقط على طول أحمر منقط. (د) هذا الإجراء غلة هيندبراين الأرض. (ﻫ–ك) التقاط الصور من المراحل الرئيسية في الإجراء ميكروديسيكشن هيندبرين. (ﻫ) الجنين هو مقطوعة الرأس بجب على طول الخط المنقط. (و) hindbrain 4th البطين، المحاطة بلوحة السقف، اقتطعت ومفصولة من الرأس بجب على طول الخطوط المنقطة. (ز) البطينال 4 الموجه صعودا قبل الرصاصات ثقب صغير في سقف لوحة (العلامة النجمية). هو اتسع الثقب تقشير الأنسجة بدقة كل روسترالي وكاودالي على طول خط الوسط (الأسهم) للكشف هيندبراين. هيندبرين هو الجانب بيل متوضعة أسفل واليسار إلى إضعاف بها في إعداد كتاب مفتوح (ح؛ والأسود يشير رأس السهم إلى الأنسجة العصبية hindbrain). إذا كان مطلوباً هيندبراين في إيمونولابيلينج ووليمونت، تتم إزالة الغشاء بيال من المتطفلين بلطف نيوروبيثيليوم هيندبراين من الأغشية السحائي المحيطة باستخدام الملقط (أنا). الزائدة midbrain (ميغابايت) والحبل الشوكي (sc) الأنسجة هو إزالة (الخطوط المنقطة في J) لعزل hindbrain (K). مقياس بار: 500 ميكرومتر (E)، 300 ميكرون (و – ك). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig2.jpg"> الشكل 2 : إيمونولابيلينج ووليمونت يمكن استخدامها لقياس ميتوسيس المجلس الوطني عبر هيندبراين- توضح التصوير تواجه أون من الشخصيات الانقسامية في طبقة البطين hindbrain التخطيطي (A). الخامس، الجانب hindbrain البطين؛ ف، الجانب هيندبرين بيل. (ب) بلاط [كنفوكل] مسح z كومة من هيندبرين e10.5 بعد إيمونولابيلينج ووليماونت على pHH3 ماركر الانقسامية (أحمر). المربع الأبيض يشير إلى منطقة سيظهر في أعلى التكبير في الفريق الثاني في (د). (ج) ما قبل طور الصعود (السهم الأبيض) والأرقام الانقسامية طور الصعود (السهم الأسود) يمكن تمييزها ضمن الفوج مجموع الانقسامية طبعا الشخصيات-(د) وقت من pHH3 ووليماونت وسم من e9.5 13.5. تغيير حجم أشرطة: 500 ميكرومتر في (ب)؛ 20 ميكرومتر (C)؛ 100 ميكرومتر (د). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig3.jpg"> الشكل 3 : الشخصيات ركوب الدراجات داخل منطقة جيرمنال الخاصة بهم في هيندبرين روسترال. (أ) التخطيطي يصور موقف الانقسامية (الأخضر) والشخصيات S-المرحلة (الأحمر) على سطح البطين هيندبرين وفي منطقة المحيط بالبطينات، على التوالي. يتم عرض شريحة افتراضية من خلال هيندبرين التكبير أعلى على اليمين. السهم الأسود يشير إلى اتجاه هجرة ذرية للمجلس الوطني أن إنهاء دورة الخلية نحو منطقة التمايز. (ب) z [كنفوكل] كومة من مقطع هيندبرين e11.0 العائمة من جنين التي تلقي ح 1 نبض إيدو؛ واستخدمت إيمونولابيلينج pHH3 وايدو تصور الانقسامية (الأخضر) والشخصيات S-المرحلة (أحمر)، على التوالي. تتم الإشارة إلى الأسطح هيندبرين بخطوط منقطة؛ الخامس، الجانب hindbrain البطين؛ ف، الجانب hindbrain بيال. ويرد في المنطقة المشار إليها بمربع أبيض في أعلى التكبير في الداخلي؛ تشير الأسهم إلى الطائرة الانقسام في مجلس الشعب في طور الصعود، بالنسبة إلى سطح البطين. (ج) قناة واحدة تعرض pHH3 إيمونولابيلينج فقط. يتم الإشارة إلى الشخصيات الانقسامية برؤوس الأسهم السماوي؛ هو أشارت إلى نقص الشعب القاعدية Δ-(د) قناة واحدة تعرض إيدو العلامات فقط. إيدو+ الشخصيات تعتمد على توزيع بسيودوستراتيفيد بسبب هجرتهم النووية إينتيركينيتيك. ويمكن قياس المسافة التي تهاجر الشخصيات بعيداً عن سطح البطين، كما هو مبين بخط برتقالي ممثل. تغيير حجم أشرطة: 100 ميكرومتر في (ب -د)؛ 10 ميكرومتر في اقحم في (ب). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig4.jpg"> الشكل 4 : بردو الجمع بين مع Ki67 وضع العلامات لتحديد القدرات الذاتي تجديد المجلس الوطني هيندبراين- (أ) ض [كنفوكل] كومة من كريوسيكشن هيندبرين e10.5 بعد وضع العلامات Ki67 (الأخضر) ونبض بردو (أحمر) بعد يوم 1 بردو. الخلايا إيجابية مزدوجة في منطقة البطين هي الشخصيات التي أدرجت بردو ولا تزال تتحرك من خلال دورة الخلية، كما ورد وصفها Ki67. نسبة الخلايا المسماة مزدوج بين مجموع السكان بردو+ يمثل النسبة المئوية لتجديد ذاتي الشخصيات. (ب، ج) واحد قنوات عرض Ki67 (ب) وإيمونولابيلينج بردو (ج) فقط. يتم الإشارة إلى خلية بردو+ التي تفتقر إلى Ki67 وقد خرجت ولذلك يرجح أن دورة الخلية على رأس سهم سماوي في (ألف،ج). تتم الإشارة إلى الأسطح هيندبراين بخطوط منقطة؛ الخامس، الجانب hindbrain البطين؛ ف، الجانب هيندبرين بيل. شريط الحجم: 50 ميكرومتر. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig5.jpg"> الشكل 5 : إيمونولابيلينج نيستين يتصور عمليات المجلس الوطني واندفيت- (أ – ج) ويوضح الفلورة ل RC2، الذي يعترف حانمه على خيوط متوسطة العصبية نيستين، مورفولوجيا المجلس الوطني عبر نيوروبيثيليوم هيندبرين. (أ) ض [كنفوكل] كومة من مقطع عائمة من هيندبرين e11.5 عقب إيمونولابيلينج RC2؛ المناطق محاصر تظهر في أعلى التكبير في (ب، ب؛ المنطقة قمي/البطين) و (ج، ج '؛ والقاعدية المنطقة). تتم الإشارة إلى الأسطح هيندبراين بخطوط منقطة؛ الخامس، الجانب hindbrain البطين؛ ف، الجانب هيندبرين بيل. (ب، ج) مكدسات z [كنفوكل] مناطق محاصر في (أ)؛ وتظهر المقاطع بصري واحد في (ب، ج ')، على التوالي. يشار مجلس الشعب اندفوت قمي ترتكز على سطح البطين سهم في (ب). يتم الإشارة إلى عمليات المجلس الوطني واحد وفاسسيكولاتيد برؤوس بيضاء وسوداء في (ج ')، على التوالي. تغيير حجم أشرطة: 100 ميكرومتر، (A)؛ 25 ميكرومتر (ب، ج). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

يوضح هذا المقال كيفية hindbrain الجنينية الماوس يمكن استخدامها كنموذج لدراسة الخلايا التنموية في كل من الجهاز كله واستعدادات قسم الأنسجة.

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو السماح بالتحليل النسيجي والعضو الكامل للدماغ الخلفي الجنيني للفأر أثناء النمو. تسمح هذه الطريقة بدراسة التطورات المتعلقة بتكوين الخلايا العصبية في الدماغ الخلفي لكائن حي نموذجي للثدييات. يعد الدماغ الخلفي النامي للفأر نموذجا ممتازا لدراسة نشاط النتوء العصبي نظرا لبنيتها المسطحة التي تسهل مراقبة أنماط تكوين الخلايا العصبية عبر العضو بأكمله.ابدأ هذا الإجراء بالقتل الرحيم لأنثى فأرة حامل موقوتة باستخدام إجراء معتمد أخلاقيا في مرحلة الحمل المطلوبة. باستخدام مقص حاد ، افتح التجويف البريتوني واستئصال الرحم بعناية. ضع الرحم المستأصل الذي يحتوي على الأجنة في طبق بلاستيكي بحجم 60 ملم يحتوي على 20 مل من PBS المثلج.قم بإجراء جميع عمليات التشريح الإضافية باستخدام مجهر تشريح. باستخدام ملقط صانع الساعات رقم خمسة ، قم بتمزيق جدار عضلة الرحم لكشف الأجنة. حرر كل جنين عن طريق قطع الحبل السري وإزالة كيس الصفار.بعد نقل كل جنين إلى طبق بلاستيكي نظيف مع PBS المثلج ، استخدم ملقط صانع الساعات رقم 55 لقطع الرأس. اختياريا ، احتفظ بقطعة صغيرة من الأنسجة لعزل الحمض النووي الجيني والتنميط الجيني اللاحق. باستخدام ملقط Watchmaker رقم 55، قم باستئصال الأنسجة التي تحتوي على الدماغ الخلفي الموازي للظهارة العصبية الخلفية وأسفلها مباشرة لفصلها عن أنسجة الوجه والدماغ الأمامي.ضع الدماغ الخلفي وأنسجة الرأس الذيلية ، الجانب الظهري لأعلى وحدد البطين الرابع المغطى بطبقة رقيقة من الأنسجة تعرف باسم لوحة السقف. اخترق لوحة السقف بعناية باستخدام ملقط صانع الساعات رقم 55 وقم بإزالة الأنسجة الزائدة بالملقط ، والتحرك بشكل مستقيم على طول خط الوسط فوق الدماغ الأوسط ثم ذيليا فوق الدماغ الخلفي والحبل الشوكي. يجب الآن الكشف عن الدماغ الخلفي في إعداد كتاب مفتوح.لتحضير الدماغ الخلفي لوضع العلامات المناعية الكاملة ، استخدم ملقط Watchmaker رقم 55 لإزالة الرأس المتبقي من اللحمة المتوسطة وأي سحايا متصلة بجانب التقشير من الدماغ الخلفي. قم بإزالة أنسجة الدماغ الأوسط والحبل الشوكي لترك أنسجة الدماغ الخلفي فقط. لتحضير الدماغ الخلفي لتقطيع الاهتزاز والتبريد، استخدم ملقط Watchmaker رقم 55 لإزالة أنسجة الدماغ المتوسط والحبل الشوكي.انقل الدماغ الخلفي من الطبق البلاستيكي إلى أنابيب مستديرة القاع بحجم ملليلترين باستخدام ماصة باستور. بعد شفط كل PBS ، قم بإصلاح الدماغ الخلفي لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية مع تحريك لطيف في 4٪ من الوزن المذاب حديثا لكل حجم فورمالديهايد المذاب في PBS. أخيرا ، اشطف الدماغ الخلفي ثلاث مرات باستخدام PBS.إذا لزم الأمر ، أعد ترطيب الأدمغة الخلفية في أوهام الميثانول المتناقصة بشكل متسلسل في PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق عند كل تركيز. ثم انقل إلى الدماغ الخلفي إلى PBS. تخلل الدماغ الخلفي لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية في PBS الذي يحتوي على PBT مع تحريض لطيف.ثم احتضان الدماغ الخلفي لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية في PBT الذي يحتوي على 10٪ مصل الماعز المعطل بالحرارة. بعد ذلك ، احتضان الأدمغة الخلفية طوال الليل كما كان من قبل في PBT الذي يحتوي على 1٪ مصل معطل للحرارة والأجسام المضادة الأولية. في اليوم التالي ، اغسل الدماغ الخلفي عند أربع درجات مئوية باستخدام PBT لمدة ساعة واحدة لكل منهما.بعد الغسيل ، احتضان الدماغ الخلفي طوال الليل عند أربع درجات مئوية في PBT الذي يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور المناسبة المستهدفة ضد الأجسام المضادة الأولية المستخدمة. احتفظ بالدماغ الخلفي في الظلام من هذه النقطة فصاعدا لحماية الفلوروفورات من التبييض الضوئي. بعد الغسيل كما كان من قبل باستخدام PBT ، قم بإصلاح الدماغ الخلفي بعد 4٪ فورمالديهايد في PBS لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للحفاظ على ارتباط الأجسام المضادة على المدى الطويل.في هذه الأثناء ، قم بتغطية شريحة المجهر الزجاجي بطبقتين من الشريط الكهربائي الأسود واستخرج مربعا صغيرا من الشريط متعدد الطبقات لإنشاء جيب كبير بما يكفي لحمل الدماغ الخلفي. بعد شطف الدماغ الخلفي لفترة وجيزة مرتين في PBS ، انقله إلى الجيب باستخدام ماصة باستور. قم بإزالة السائل الزائد وأضف كاشفا مناسبا مضادا للبهتان إلى الجيب.ثم قم بتغطية الدماغ الخلفي ببطء بغطاء زجاجي لتجنب محاصرة فقاعات الهواء تحت الغطاء. أغلق الغطاء وألصقه على الشريحة بطبقة رقيقة من طلاء الأظافر. قم بتخزين الشريحة عند أربع درجات مئوية في الظلام حتى الحصول على الصورة.قم بتضمين الأدمغة الخلفية في الاغاروز المنصهر بنسبة 3٪ من الوزن لكل حجم محضر في الماء المقطر. ينقل القطع أقسام الدماغ الخلفي إلى سمك 70 ميكرون باستخدام اهتزاز. انقل كل قسم مقطوع حديثا بفرشاة رسم إلى بئر واحد من طبق 24 بئرا يحتوي على PBS مثلج.بعد تسمية الأقسام العائمة كما هو مفصل في بروتوكول النص ، اغسلها لفترة وجيزة في PBS. انقل الأقسام العائمة بعناية إلى شريحة مجهر زجاجي باستخدام فرشاة الرسم. امسح PBS الزائد حول القسم باستخدام ورق أو مناديل ورقية.ليست الأقسام التي تستخدم 80٪ من الجلسرين في PBS. وقم بتغطيتها ببطء بغطاء زجاجي لتجنب احتجاز فقاعات الهواء. قم بتخزين الشريحة عند أربع درجات مئوية في الظلام حتى الحصول على الصورة.احتضان الدماغ الخلفي بوزن 30٪ لكل حجم سكروز في PBS عند أربع درجات مئوية لحماية الدماغ الخلفي بالتبريد قبل التجميد. اغمر الدماغ الخلفي في مركب درجة حرارة القطع البصري أو OCT. بعد ذلك ، قم بتجميدها بسرعة عن طريق نقل القوالب التي تحتوي على الأمطار الخلفية إلى الأيزوبنتان المبرد إلى ما بين 40 و 50 درجة مئوية على الجليد الجاف.بعد ذلك ، قم بقص أقسام الدماغ الخلفي بسمك 10 ميكرون باستخدام ناظم البرد. انقل أقسام الدماغ الخلفي إلى شرائح مجهر لاصقة إلكتروستاتيكي. احتضن الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة لتجفيف الأقسام على الشرائح.ثم اغسل أقسام التبريد باستخدام PBS لإذابة OCT. ضع علامة على حاجز كاره للماء حول أقسام التبريد باستخدام قلم PAP. قم بتصوير العينات باستخدام مجهر المسح الضوئي بالليزر Epi-fluorescent أو متحد البؤر المزود بعدسات مناسبة للشرائح المثبتة على الوسائط المائية بالإضافة إلى مرشحات بصرية مناسبة للفلوروفورات المستخدمة في وضع العلامات المناعية.لتصوير الدماغ الخلفي بالكامل أو قسم الدماغ الخلفي ، استخدم عدسة للتكبير 10 مرات. لتصور مناطق الدماغ الخلفي للقياس الكمي ، استخدم تكبير 40 مرة. ولتصور الخلايا الفردية ، استخدم عدسة بتكبير 63 مرة.تظهر هنا نتائج تمثيلية من الأدمغة الخلفية المناعية الكاملة لمراقبة انقسام الخلايا السلفية العصبية في المنطقة البطينية. تم الحصول على هذه الصور باستخدام علامة الانقسامية فوسفو هيستون H3 في مراحل متتالية من التطور. تم تصنيف أقسام الاهتزاز المستعرضة بعد نبضة مدتها ساعة واحدة من EdU لتسليط الضوء على الخلايا السلفية العصبية للدماغ الخلفي التي تخضع للهجرة النووية بين الحركية بالإضافة إلى الخلايا الإيجابية للفوسفو هيستون H3 الانقسامية على سطح البطين.يمكن تحديد النسبة الإجمالية للخلايا السلفية العصبية ذاتية التجديد عن طريق حساب النسبة المئوية للخلايا الموجبة المزدوجة Ki67 BrdU باللون الأصفر بين جميع الخلايا الإيجابية BrdU باللونين الأحمر والأصفر في أقسام التبريد العرضية للدماغ الخلفي من الأجنة بعد يوم واحد من إعطاء BrdU. يمكن أيضا تصنيف أقسام اهتزاز الدماغ الخلفي بجسم مضاد لبروتين الخيوط الوسيط Nestin المعروف أيضا باسم RC-2 لتصور نهاية الخلية السلفية العصبية والنتوءات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل مستحضر التثبيت المسطح أو أقسام الأنسجة المستعرضة من الدماغ الخلفي.بمجرد إتقان ، يمكن تشريح ما يصل إلى 10 أدمغة خلفية في أقل من ساعة واحدة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم استخدام PBS البارد المثلج إذا كنت تتعرف أولا على التشريح الدقيق للدماغ الخلفي لأن هذا يسهل الانفصال عن السحايا ، بالإضافة إلى ضمان الحفاظ على الأنسجة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل قياس التدفق الخلوي على معلقات الخلية المفردة في الدماغ الخلفي لفصل الأسلاف العصبية عن أنواع الخلايا الأخرى.مهد إنشاء هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأعصاب التنموي لاستكشاف آليات تكوين الخلايا العصبية للثدييات باستخدام الدماغ الخلفي كبديل لنماذج الحبل الشوكي والدماغ الأمامي المستخدمة تقليديا. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة على تكوين الخلايا العصبية للدماغ الخلفي للثدييات ولكن يمكن أيضا تطبيقها على الفقاريات النامية الأخرى نظرا لدرجة التشابه الهيكلي والجزيئي بين الأنواع. قد تساعد هذه التقنية في اكتشاف آليات جديدة تتحكم في تكوين الخلايا العصبية وتساعد في تحديد ما إذا كانت تلك التي تم تحديدها في مكان آخر في المحور قد تم تلخيصها في هذا الجزء من دماغ الفقاريات.

the-mouse-hindbrain-as-a-model-for-studying-embryonic-neurogenesis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

يوصف أسلوب لتوليد شرائح عضوي النمط من الدماغ المتوسط ​​E12.5 الفئران الجنينية. يمكن استخدام شريحة عضوي النمط الثقافات لمراقبة سلوك الخلايا العصبية الدوبامين العصبية الدماغ المتوسط ​​أو غيرها من بطني.

الثقافات شريحة عضوي النمط من المخ الأوسط بطني الجنينية : نظام لدراسة التنمية متعلق بالخلايا العصبية الدوبامينية في المختبر</em

يقدم هذا الفيديو طريقة لتوليد سلائف الخلايا العصبية الداخلية القشرية من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر. يستلزم البروتوكول زراعة الخلايا الجذعية في وسائط تحتوي على مثبطات جزيئات صغيرة محددة ، مما يسهل تكاثر الخلايا الجذعية وتجميعها في أجسام جنينية (EBs). بعد ذلك ، يتم فصل EBs عن الإنزيمات وطلاءها على آبار لوحة الاستزراع المغلفة ببروتينات الالتصاق لتعزيز تمايزها إلى سلائف الخلايا العصبية القشرية.

توليد سلائف الخلايا العصبية الداخلية القشرية من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر

كيف يتم إنشاء شبكات الخلايا العصبية في الدماغ الجنينية هي المسألة الأساسية في علم الأعصاب التنموي. هنا نحن الجمع بين تقنية electroporation مع الأدوات الوراثية الرواية، مثل لجنة المساواة العرقية / السلمون المدخن، البلازميدات وPiggyBac بوساطة نظام تبديل الحمض النووي في الدماغ المؤخر الطيور لتسمية interneurons الظهرية وتتبع التوقعات محور عصبي والأهداف متشابك في مراحل النمو المختلفة.

Electroporation من الدماغ المؤخر لتتبع مسارات محور عصبي والأهداف متشابك في الجنين الفرخ

وعلى الرغم من أهمية وظيفية والطبية من منطقة ما تحت...

التلاعب الجيني من الفأرة النامية من خلال المهاد<em&gt; في الرحم</em&gt; Electroporation

وصفت وسائل للتلاعب وتحليل NF كيلوبايت التي تعتمد على تكوين الخلايا العصبية الحصين الكبار. ويرد بروتوكول مفصلة لاختبار تعتمد على التلفيف المسنن السلوكية (وهو ما يسمى نمط المكاني فصل بارنز متاهة) للتحقيق في نتائج المعرفية في الفئران. هذا الأسلوب من شأنه أن يساعد أيضا تمكين التحقيقات في إعدادات التجريبية الأخرى.

طرق لتعديل وتحليل NF كيلوبايت التي تعتمد على تكوين الخلايا العصبية الكبار

العصبية السلف الانقسام هو معلمة الحرجة من تكوين الخلايا العصبية. ويستند جزء كبير من فهمنا لالعصبية السلف الانقسام على تحليل الأنسجة الثابتة. تصوير حي في شرائح المخ الجنينية هي تقنية متعددة لتقييم الانقسام مع القرار الزماني والمكاني عالية في بيئة تسيطر عليها.

التصوير حية من الانقسام في تطوير الجنينية الماوس اللحاء

يولدون الخلايا العصبية الجنينية في منطقة البطين في الأنبوب العصبي، ولكن الهجرة للوصول إلى الأهداف المناسبة. branchiomotor الوجه (FBM) الخلايا العصبية هي نموذجا مفيدا لدراسة هجرة الخلايا العصبية. يصف هذا البروتوكول wholemount فيفو السابقين ثقافة الماوس hindbrains جنين للتحقيق في الآليات التي تنظم الهجرة FBM.

الماوس الدماغ المؤخر<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; الثقافة لدراسة الهجرة Branchiomotor الوجه العصبية

تحدي الشباب من الخلايا العصبية في مناطق الدماغ جديدة يمكن أن تكشف عن معلومات هامة بشأن كيفية البيئة sculpts مصير الخلايا العصبية والنضج. يصف هذا البروتوكول إجراء الحصاد السلائف إينتيرنيورون من مناطق محددة من الدماغ وزرع لهم أما هوموتوبيكالي أو هيتيروتوبيكالي في دماغ الجراء بعد الولادة.

زرع هوموتشرونيك إينتيرنيورون السلائف في أوائل العقول الماوس بعد الولادة

يقدم هذا البروتوكول طريقة فريدة لتوليد مزارع خلايا الجهاز العصبي المركزي من أدمغة الفئران الجنينية في اليوم 17 لأبحاث علم الأعصاب (المناعة). يمكن تحليل هذا النموذج باستخدام تقنيات تجريبية مختلفة ، بما في ذلك RT-qPCR ، والفحص المجهري ، و ELISA ، وقياس التدفق الخلوي.

إنشاء مزارع مختلطة للخلايا العصبية والدبقية من أدمغة الفئران الجنينية لدراسة العدوى والمناعة الفطرية

أثناء تطور القشرة الدماغية ، تنشأ الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في منطقة البطين المبطنة للبطين وتهاجر نحو سطح الدماغ. تشارك العديد من الجينات في هذه العملية. يقدم هذا البروتوكول تقنية التصوير بفاصل زمني للخلايا العصبية المهاجرة والأسلاف الدبقية.

تصوير الفاصل الزمني للخلايا العصبية المهاجرة والأسلاف الدبقية في شرائح دماغ الفأر الجنينية

استكشف تحليل الدماغ الخلفي الجنيني للفأر لدراسة تكوين الخلايا العصبية في نمو الأعصاب. يوضح هذا البروتوكول كيفية عزل الأنسجة وإعدادها للتصوير المناعي.

هيندبراين الماوس كنموذج لدراسة الخلايا الجنينية

استكشف المزيد من الفيديوهات