البروتوكول التجريبي للكشف عن وظيفة الميتوكوندريا في خلايا الكبد المعرضة لمبيدات الآفات أورجاكلوري

انها مُسرّة التي تستدعي الإجابة على سؤال رئيسي أن لديك في أيضا وظيفة من حقل مثل ATP مستوى ومعدلات استهلاك الأوكسجين. الجديد أو صفحة واحدة القديمة، وهذا الأسلوب هو أنه من السهل على أداء وانها الكثير لتقييم خاص لوظيفة الميتوكوندريا الخلوية. لبدء هذه التجربة، بذور 20، 000 خلايا HepG2 في طبق بيتري القاع الزجاج.

يضاف بيتا - سداسية كلور حلقي الهدكان أو B-HCH في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية وخمسة في المائة من ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. إعداد واحد ململي الميتوكوندريا الخضراء المفلورة حل التحقيق عن طريق إضافة DMSO اللامائية إلى خلية DMEM المتوسطة. ثم إضافة ملليلتر واحد لكل طبق من هذا الحل للخلايا في الأطباق بيتري القاع الزجاج.

واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. بعد الحضانة، وإزالة محلول مسبار الفلورسنت الأخضر الميتوكوندريا من الخلايا. إضافة ملليلتر واحد لكل طبق من إعداد طازجة في 37 درجة مئوية DMEM خلية ثقافة المتوسطة.

للكشف عن الفلوروست الأخضر في الميتوكوندريا، لاحظ الخلايا تحت المجهر confocal. لتقييم مستويات ATP الخلوية، بذور إلى 20، 000 خلايا HepG2 في ستة لوحات جيدا. يضاف بيتا -HCH واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

إضافة 200 ميكرولترات من العازلة تحلل إلى الخلايا في كل بئر. أجهزة الطرد المركزي في 12،000 مرة G لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية، والمضي قدما في جمع فائقة كما هو موضح في بروتوكول النص. إضافة 100 microliters ATP الكشف عن العازلة إلى لوحة.

إضافة 100 ميكرولترات من الخلايا التي تم جمعها supernatant إلى لوحة 96 بئر في درجة حرارة الغرفة وشرع في الكشف عن ATP الخلوية عن طريق luminometer كما هو موضح في بروتوكول النص. لتقييم إمكانات غشاء الميتوكوندريا، ينمو خلايا HepG2 في ستة صحون من الآبار مع إضافة بيتا HCH، كما سبق وصفه. جمع الخلايا عن طريق هضمها مع 0.5 ملليلتر 0.25٪ EDTA لمدة دقيقة واحدة في 37 درجة مئوية.

أضف ملليلتر واحد DMEM لوقف الهضم ونقل الخلايا المهضوبة إلى 1.5 ملليلتر أنابيب. الطرد المركزي الأنابيب في 1000 مرة G لمدة ثلاث دقائق، ومن ثم التخلص من فائقة. تخفيف بيليه الخلية مع 0.5 ملليلتر من خلية ثقافة المتوسطة و0.5 ملليلتر JC1 صبغة غشاء الميتوكوندريا المحتملة.

واحتضان لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية. بعد ذلك، الطرد المركزي الأنابيب في 600 مرة G لمدة ثلاث دقائق في أربع درجات مئوية، ومن ثم غسل بيليه الخلية وفقا لبروتوكول النص. بعد الطرد المركزي بيليه غسلها، وإزالة سوبرنات.

وإعادة تعليق بيليه في 0.5 ملليلتر من JC1 العازلة الصباغة. تحليل الخلايا الملطخة JC1 عن طريق تدفق الخلايا الجذعية للكشف عن الفلورس الأخضر والأحمر. عند اكتشاف مونومر JC1، قم بتعيين ضوء الإثارة إلى 490 نانومتر والضوء المنبعث إلى 530 نانومتر.

عند اكتشاف بوليمر JC1، قم بتعيين ضوء الإثارة إلى 525 نانومتر والضوء المنبعث إلى 590 نانومتر. لتحليل معدل استهلاك الأكسجين، بذور خلايا HepG2 في 96 بئر خلية لوحة ثقافة في كثافة 4,500 خلية لكل 100 ميكرولترات لكل بئر. بعد 24 ساعة من الحضانة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، تأكد من أن الخلايا في كل بئر مغطاة بالمتوسطات.

قبل تشغيل برنامج OCR، قم بتحميل اللوحة الدقيقة بخراطيش ولوحة ثقافة الخلية في محلل تدفق خارج الخلية كما هو موضح في بروتوكول النص. افتح برنامج OCR وفي قائمة التطبيقات المنسدلة، واختر مجموعة اختبار الإجهاد الخلوي، وانقر على زر بدء التطبيق. بعد ذلك، انقر على زر اختبار الإرهاق.

عند ظهور شاشة اختبار إجهاد الخلية، أدخل عدد الخلايا البذر لكل بئر في مربع رقم البذر في الخلية ومتوسط OCR في المتوسط في مربع OCR للخلايا القاعدية. أدخل تركيز العمل النهائي لكل كاشف ثم حقن الكواشف. انقر على الزر التالي.

عند ظهور شاشة معلومات المجموعة، قم بتعيين مجموعة لآبار غير معينة عن طريق اختيار لون وإعطاء اسم. ثم انقر على الآبار المناسبة. انقر فوق الزر التالي وفي اختبار الإجهاد حقن الشاشة التي تظهر، انقر فوق بدء تشغيل اختبار الإجهاد على محلل.

بعد اكتمال التشغيل، اتبع المطالبات في البرنامج ثم قم بإزالة الكارتريدج ولوحة الخلية وتجاهلها. وانخفض متوسط كثافة التلطيخ الفلوري الأخضر الميتوكوندريا في خلايا HepG2 المعرضة لبيتا سداسي chch. وهذا يدل على أن هناك انخفاضاً في عدد الميتوكوندريا وزيادة في الميتوكوندريا التالفة بما يتفق مع الزيادة في تركيز مبيدات الآفات.

وعلاوة على ذلك، انخفضت مستويات ATP في خلايا HepG2 مع زيادة تركيزات التعرض بيتا-HCH، مما يدل على انخفاض وظيفة الميتوكوندريا في هذه الخلايا. بعد تلطيخ JC1 لاحتمالات غشاء الميتوكوندريا، أو MMP، أظهر مقياس التدفق للخلايا ارتفاع الفلوري JC1 الأخضر الأحمر في خلايا HepG2 سليمة. ويرجع ذلك إلى وجود مجاميع الفلورسنت الحمراء JC1، والتي هي علامة على MMP عالية.

في الخلايا المعالجة بـ بيتا-HCH، انخفض اللون المفلوري JC1 الأخضر الأحمر بسبب وجود مونومرات الفلورسنت الخضراء JC1، وهي علامة على انخفاض MMP. وأخيراً، انخفض معدل استهلاك الأكسجين أيضاً مع زيادة تركيزات التعرض لمادة سداسي كثامير سداسي كثنونية بيتا، مما يدل كذلك على أن هذا المبيد يضعف وظيفة الميتوكوندريا المناسبة. حسناً، حاولي هذا الإجراء، من المهم أن تتذكري أن تري تلك الخلايا مناسبة لإختبارها

بعد تطويره ، وهذا بالتأكيد يمهد الطريق للبحوث في مجال الوظيفة الأساسية لاستكشاف الكائنات الحية ذات الصلة في الدور الطبي المرتبطة به. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الكشف عن كمية أو جودة ، والقدرة ، والآن عضو أو المحتملة تحت وظيفة ورقة spoutage.