عزل الحمض النووي قوية وبناء مكتبة التسلسل الفائق للعينات دار النباتات

الهدف العام لهذا البروتوكول هو زيادة كمية الحمض النووي المعزول مزدوج الشريطة ومكتبات التسلسل اللاحقة عالية الإنتاجية من عينات المعشبة ، مما يزيد من فائدتها في دراسات علم النشوء الجيني. تطلق هذه الطريقة إمكانات عينات المعشبة التي لن تكون مفيدة لولا ذلك لمشاريع التسلسل كتسلسلات جينومية بسبب تدهور العينة على نطاق واسع. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها قوية بما يكفي بحيث يمكن استخدام عينات الأعشاب النادرة والمهمة تاريخيا دون الحاجة إلى أخذ عينات مدمرة واسعة النطاق.

تعمل هذه التقنية على توسيع عمق أخذ عينات الأصناف في المشاريع المتباعدة المنهجية. يعد اكتساب الأنواع خطوة مقيدة ، ولكن باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن استخدام المجموعات التاريخية بسهولة في هذه الدراسات. أضف النيتروجين السائل و 30 إلى 50 ملليغرام من الرمل المعقم لطحن سنتيمتر مربع واحد من أنسجة الأعشاب المختارة مسبقا إلى مسحوق ناعم في الملاط والمدقة المبردة مسبقا.

الطحن الكافي ضروري لعزل الحمض النووي الناجح. ويجب الحرص على أن يتم سحق العينة بالكامل. بعد ذلك ، أضف المسحوق المجمد إلى أنبوبين سعة ملليلتر ، ولا يملأ أكثر من نصف حجم الأنبوب.

ثم أضف 600 ميكرولتر من محلول CTAB الدافئ إلى كل أنبوب. امزج المسحوق جيدا عن طريق التقليب والدوامة. ثم احتضان العينات في حمام مائي يتم الحفاظ عليه عند 65 درجة مئوية لمدة ساعة إلى 1.5 ساعة.

في غضون ذلك ، دوامة كل 15 دقيقة. ثم قم بالطرد المركزي للعينات عند 10 ، 000 جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي ، انقل ما يقرب من 500 ميكرولتر من المادة الطافية إلى مجموعة جديدة وجديدة من الأنابيب المصنفة.

إلى المادة الطافية ، أضف أربعة ميكرولترات من 10 ملليغرام لكل مليلتر من RNase A إلى كل نغمة. ثم امزج محتويات الأنبوب عن طريق الرجوع إلى الوجه أو سحب العينات. احتضان العينات في كتلة حرارية أو حمام مائي يتم الحفاظ عليه عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

بمجرد حصول الأنابيب على درجة حرارة الغرفة ، أضف ما يقرب من 500 ميكرولتر من خليط الفينول والكلوروفورم والكحول الأيزواميل 25:24: 1 إلى العينات. ثم امزج محتويات الأنابيب عن طريق عكس أو سحب العينات المتكرر. ثم قم بالطرد المركزي للعينات عند 12 ، 000 جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

انقل الطبقة المائية العليا ، والتي تبلغ حوالي 400 ميكرولتر ، إلى مجموعة جديدة من الأنابيب الملصقة. إلى الطبقة المائية في كل أنبوب ، أضف ما يقرب من 400 ميكرولتر من خليط الكلوروفورم 24: 1 ، إيزوأميل. امزج العينة جيدا عن طريق سحب العينات أو الانعكاس المتكرر.

ثم قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 12 ، 000 جم لمدة خمس دقائق وانقل ما يقرب من 300 ميكرولتر من الطبقة المائية العليا إلى أنابيب مبردة مسبقا وتحمل علامة عليها. بعد ذلك ، أضف 300 ميكرولتر من الأيزوبروبانول المبرد مسبقا و 12 ميكرولتر من أسيتات الصوديوم 2.5 مولار. ثم احتضان الأنابيب عند سالب 20 درجة مئوية لمدة 30 إلى 60 دقيقة.

بعد الحضانة ، قم بإزالة العينات من الفريزر. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 12 ، 000 جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي ، اغسل الحبيبات بحوالي 300 إلى 500 ميكرولتر من 70٪ من الإيثانول.

مرة أخرى ، قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 12 ، 000 جم لمدة 10 دقائق. ثم دون إزعاج الحبيبات ، قم بإزالة المادة المطفية بعناية. بعد ذلك ، جفف الكريات بالهواء وقم بإذابة الحمض النووي في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت 1X Tris-EDTA.

أضف واحدا إلى 16 ميكرولترا من الحمض النووي المعزول وميكرولترين من المخزن المؤقت لتفاعل التجزئة في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل سعة 0.2 ملليلتر. اضبط الحجم النهائي على 18 ميكرولترا بماء خال من النوكلياز. بعد ذلك ، أضف ميكرولترين من إنزيم تجزئة الحمض النووي مزدوج الشريطة وقم بدوامة الخليط لفترة وجيزة لثوان الشجرة.

ثم احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 8.5 دقيقة في التدوير الحراري. بعد الحضانة ، أضف خمسة ميكرولترات من 0.5 مولار EDTA إلى الأنابيب. أضف 25 ميكرولترا من الماء الخالي من النوكلياز لضبط الحجم الكلي للحمض النووي المنفصم إلى 50 ميكرولترا.

ثم أضف 45 ميكرولترا من حبات SPRI المحفوظة في درجة حرارة الغرفة إلى 50 ميكرولترا من الحمض النووي المنفصم واخلطهما جيدا عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل. اترك العينة التي تحتوي على الأنابيب لمدة خمس دقائق. ثم انقل الأنابيب على لوحة مغناطيسية وانتظر لمدة خمس دقائق أخرى.

طرد بعناية طاف. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول الطازج بنسبة 80٪ إلى الأنابيب الموجودة على الحامل المغناطيسي وانتظر لمدة 30 ثانية أخرى في درجة حرارة الغرفة. بعد 30 ثانية ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية.

اترك غطاء الأنبوب مفتوحا لتجفيف الخرزات بالهواء لمدة خمس دقائق على الحامل المغناطيسي. ثم قم بإزالة الأنابيب من حامل المغناطيس وقم بإخراج الحمض النووي من الخرزات في 55 ميكرولتر من المخزن المؤقت 0.1X Tris-EDTA. امزج الحمض النووي جيدا عن طريق سحب العينات المتكرر.

ثم احتضان العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. مرة أخرى ، ضع الأنبوب على الحامل المغناطيسي وانتظر حتى يزول المحلول في غضون دقيقتين تقريبا. قم بإزالة 52 ميكرولترا من المادة الطافية ثم قم بإجراء تحليل كمية الحمض النووي كما هو موضح في بروتوكول النص.

إلى 50 ميكرولترا من الحمض النووي النظيف والمنفصم ، أضف ثلاثة ميكرولترات من إندونوكلياز ، وإنزيمات مخلفات الفوسفات ، وسبعة ميكرولترات من المخزن المؤقت للتفاعل. امزج الحمض النووي والمكونات الأخرى جيدا عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل. ثم قم بتدوير الأنابيب لإزالة الفقاعات.

بعد الدوران ، انقل العينات إلى جهاز تدوير حراري واضبط البرنامج. قم بتخفيف المحول من 25 إلى 50 ضعفا لتحقيق تركيز عمل من 0.6 إلى 0.3 ميكرومولار. للحصول على تسلسل قصير القراءة عالي الإنتاجية ، أضف 30 ميكرولترا من مزيج الربط الرئيسي ، وميكرولتر واحد من محسن الربط ، و 2.5 ميكرولتر من المحول للأنابيب.

امزج محتويات الأنابيب جيدا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. مرة أخرى ، قم بتدوير الأنابيب لإزالة أي فقاعات. ثم احتضان الأنبوب عند 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

أضف ثلاثة ميكرولترات من الخليط التجاري من جليكوزيلاز اليوراسيل الحمض النووي والحمض النووي جليكوسيلاز لياز إندونوكلياز الثامن إلى الأنابيب. اضبط الحجم الإجمالي على 96.5 ميكرولتر. امزج المكونات جيدا واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في الدراجة الحرارية.

في الأنبوب ، قم بإعداد مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق إضافة جميع الكواشف إلى الحمض النووي النظيف والمرتبط بالمحول. ثم امزج التفاعل جيدا عن طريق الدوامة. بمجرد انتهاء الدوامة ، ضع العينات في جهاز التدوير الحراري وابدأ إعداد تضخيم التدوير الحراري.

أضف حوالي 25 ميكرولترا من الخرز المغناطيسي المحفوظ في درجة حرارة الغرفة إلى العينة واخلطها عن طريق سحب العينات المتكرر. احتضان العينة لمدة خمس دقائق. ثم انقل الأنابيب على حامل مغناطيسي وانتظر لمدة خمس دقائق أخرى.

بعد خمس دقائق ، قم بإزالة المادة الطافية إلى مجموعة جديدة من الأنابيب ذات العلامات المناسبة. بعد ذلك ، إلى المادة الطافية ، أضف ستة ميكرولترات من حبات SPRI المحفوظة في درجة حرارة الغرفة واخلطها جيدا. بعد احتضان العينات لمدة خمس دقائق ، انقل الأنابيب على اللوحة المغناطيسية وانتظر خمس دقائق أخرى.

قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها. ثم أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول الطازج بنسبة 80٪ إلى الأنابيب الموجودة على الحامل المغناطيسي. بعد ذلك ، احتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية.

بعد 30 ثانية ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية وجفف الخرزات بالهواء لمدة خمس دقائق مع فتح غطاء الأنبوب بينما لا يزال على الحامل المغناطيسي. الآن قم بإزالة الأنابيب من المغناطيس. قم بمسح الحمض النووي المستهدف من الخرزات إلى 33 ميكرولتر من المخزن المؤقت Tris-EDTA 0.1X ويخضع للخلط الشامل.

بعد الخلط المناسب ، احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ثم انقل الأنابيب إلى الحامل المغناطيسي وانتظر لمدة دقيقتين تقريبا حتى يصبح المحلول صافيا. ماصة 30 ميكرولتر من المادة الطافية إلى أنابيب ملليلتر للتخزين.

لإظهار عزلة الحمض النووي بالأعشاب ، تم تشغيل هلام الاغاروز باستخدام الحمض النووي المزدوج الشريطة المعزول من عينات المعشبة المختلفة. باستخدام 10 ملليغرام من أنسجة الأوراق ، تم تحميل ما يقرب من 3.56 إلى 2 ، تم تحميل 610 نانوغرام من الحمض النووي مزدوج الشريطة المعزول على هلام الاغاروز. يظهر الجل الحمض النووي المعشبي المتدهور في شكل مسحة في جميع الممرات.

بعد ذلك ، من أجل إظهار استعادة مكتبة التسلسل عالية الجودة من الحمض النووي المعزول من 10 عينات من المعشبة ، تم تشغيل هلام الاغاروز. قبل التحميل على هلام الاغاروز ، تم إخضاع ما يقرب من 1.26 إلى 464 نانوغرام من الحمض النووي المعشبي المعزول للقص الأنزيمي والتنظيف بحجم حبة 90٪. يظهر جل الاغاروز استعادة مكتبة تسلسل عالية الجودة من الحمض النووي ل 10 عينات من المعشبة.

مكتبات التسلسل النهائية نطاقا أساسيا يتراوح بين 300 إلى 500 زوج أساسي. ثم لإظهار تسلسل البندقية للحمض النووي المشتق من المعشبة ، تم الحصول على قطعة أرض دائرية من جينوم البلاستيدات الخضراء TK 686. يوضح التسلسل الطول الإجمالي للحمض النووي ، ومنطقة التكرار المقلوبة ، ووجود مناطق كبيرة وصغيرة أحادية النسخة.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية على 24 عينة في أقل من 13 ساعة مع حوالي ثماني ساعات فقط من الوقت العملي النشط. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل التقاط التسلسل ، على المكتبات الناتجة لتوليد البيانات النووية لدراسات النشوء والتطور.