كريسبر/Cas9-بوساطة التكامل المستهدفة في فيفو استخدام استراتيجية تستند إلى الانضمام إلى التماثل بوساطة نهاية

الهدف العام لاستراتيجية HMEJ هذه هو توفير أداة وراثية واعدة لمجموعة متنوعة من التطبيقات ، بما في ذلك توليد النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا والعلاجات الجينية المستهدفة. أقر HMEJ هذا الإجراء. يمكن أن يكون أيضا أسئلة رئيسية في المجال الجيني والعصبي.

مثل كيفية تحسين كفاءة التكامل الدقيق المستهدف للجينات المعدلة وراثيا في الجسم الحي. الميزة الرئيسية لهذه الإستراتيجية القائمة على HMEJ هي القدرة على تصحيح الطفرات الجينية بكفاءة عالية في الجسم الحي. الذي تبع ذلك علاجي في الإمكانات.

سيوضح الإجراء شينغ وانغ ، طالب دراسات عليا من مختبري. لبدء البروتوكول ، اجمع 5000 خلية N2a ، تم نقلها مسبقا باستخدام نواقل تعبير Cas9 sgRNA EGFP عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة أو FACS ، باستخدام الخلايا غير المنقولة كعنصر تحكم. هضم الخلايا المجمعة في 2 إلى 5 ميكرولتر من محلول التحلل عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

ثم سخني ونشط البروتيناز K عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. قم بتضخيم العينة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل باستخدام بروتوكول الشركة المصنعة. امزج ميكرولتر واحد من منتج التحلل مع بوليميراز الحمض النووي وزوج من البادئات الخارجية للتعرف على التسلسل حول الموقع المستهدف sgRNA وقم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الأولي بحجم إجمالي قدره 20 ميكرولترا.

بعد ذلك ، قم بتنشيط بوليميراز الحمض النووي عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الأولي مع امتداد نهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الثانوي باستخدام ميكرولتر واحد من منتج PCR الأولي وزوج من الاشعال الداخلية المتداخلة. قم بتغيير طبيعة وإعادة تلدين 300-600 نانوجرام من منتج PCR المنقى في 20 ميكرولتر من 1x TC7EI عازل تفاعل.

أضف ميكرولتر واحد من إنزيم T7EI إلى منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل الملدن وهضمها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. ثم قم بتشغيل منتج الهضم على 2٪ جل agarose و 1x TAE buffer عند 120 فولت لمدة 40 دقيقة ، حتى يتم فصل الشظايا. استخدم ImageJ لتحديد شدة النطاق للحمض النووي المقطوع وغير المقطوع وحساب تردد indel.

لإعداد Cas9 mRNA ، أضف تسلسل محفز T7 إلى منطقة ترميز Cas9 عن طريق تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). بعد ذلك ، أضف التمهيدي Cas9 FR بتركيز نهائي قدره 0.1 ميكرومولار و 20 نانوغرام من Cas9 يعبر عن المتجه إلى مزيج بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة 1x. اضبط الحجم النهائي على 50 ميكرولتر بالماء الخالي من النوكلياز.

قم بتنشيط بوليميراز الحمض النووي عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وقم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). قم بتنقية منتج T7 Cas9 و PCR للنسخ في المختبر ، أو IVT. ثم انسخ 0.5 إلى 1 ميكروغرام من الحمض النووي ، باستخدام مجموعة نسخ mRNA عند 37 درجة مئوية لمدة 8 ساعات بحجم إجمالي قدره 20 ميكرولترا.

أضف 1 ميكرولتر من DNase إلى الخليط لإزالة قالب الحمض النووي عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد إضافة ذيل بولي (A) لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، استرجع Cas9 mRNA باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الريبي. قم بإنشاء قالب sgRNA مدفوعا بواسطة محفز T7 مع بوليميراز DNA عالي الدقة كما تم إجراؤه في القسم السابق واختر سقالة sgRNA تحتوي على متجه كقالب.

بعد تنقية منتج T7 sgRNA PCR ، استخدم 0.5 إلى 1 ميكروغرام من الحمض النووي كقالب للنسخ المختبري ل sgRNA باستخدام مجموعة نسخ قصيرة من الحمض النووي الريبي عند 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات ، بحجم إجمالي يبلغ 20 ميكرولترا. بعد 6 ساعات من الحضانة ، أضف 1 ميكرولتر من DNase إلى الخليط واستمر في الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لإزالة قالب الحمض النووي. قم بتنقية sgRNAs مرة أخرى باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الريبي.

قم بتخفيف sgRNA إلى 500 نانوغرام لكل ميكرولتر في الماء الخالي من RNase وتخزين العينات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر. تعد الجودة العالية ل Cas9 mRNA و sgRNA بدون تنكس والخط الصحيح لمعلمات مانح HMEJ من أهم الخطوات في توليد الفئران الضارة. ضع الأجنة المخصبة في وسط KSOM عند 37 درجة مئوية في حاضنة بها 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

امزج 100 نانوجرام لكل ميكرولتر من Cas9 mRNA ، و 50 نانوغرام لكل ميكرولتر من sgRNA ، و 100 نانوجرام لكل ميكرولتر من ناقل HMEJ المتبرع وأضف الماء لضبط الحجم النهائي إلى 10 ميكرولترات. قم بعرض الخليط لأعلى ولأسفل وضعه على الثلج. بعد ذلك ، اسحب الإبر الشعرية باستخدام مجتذب ماصة دقيقة.

حقن حجما محتملا من الخليط في سيتوبلازم البيضة الملقحة ذات النوى المحددة جيدا في قطرة من وسط HEPES-CZB تحتوي على 5 ميكروغرام لكل مليلتر من السيتوكالاسين B باستخدام حاقن دقيق مع إعدادات تدفق ثابتة. أخيرا ، استزراع البيضة البيقية المحقونة في وسط KSOM عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى مرحلة الكيسة الأريمية بعد 3 1/2 أيام لمراقبة التألق. بعد 3 أيام من الحقن ، كانت 12.9٪ من الأكياس الأريمية التي تلقت متبرعين ب HMEJ إيجابية ل mCherry ، والتي تم التعبير عنها بدقة في الأديم الغاذي.

من خلال تسلسل الفئران الإيجابية PCR ، كانت جميع أحداث التكامل التي تم فحصها عبارة عن تكاملات دقيقة في الإطار في كل من 5 تقاطعات أولية و 3 تقاطعات رئيسية. بعد 7 أيام من الحقن ، كشفت صور الفلورسنت المناعي أن ما يقرب من نصف خلايا الكبد المنقولة عبرت عن mCherry على أنها ملطخة على أقسام الكبد. بعد انسحاب NTBC ، أظهر تلطيخ الكبد في الكيمياء النسيجية المناعية لخلايا الكبد المصححة لفئران Fah السلبية التي تتلقى تركيبات Fah HMEJ و Cas9 انتشارا أكثر فعالية من الطريقة القائمة على MMEJ.

يمكن أن تكون الإستراتيجية القائمة على HMEJ منصة مثالية لاستبدال التسلسل المتحور مثل جزء من الطفرة بالتسلسل الصحيح. وهو أمر لا ينطبق على الطريقة القائمة على HHEJ. بعد هذه التجربة ، يمهد هذا العلاج الطريق للباحثين في مجال حيث التكامل الدقيق للهدف لاستكشاف تطبيقات العلاج الواسعة.