التقاط حركية التفاعل البروتين قناة أيون مع جزيئات صغيرة بمقايسة التداخلي بيو-طبقة

العام من قياس تداخل الطبقة الحيوية أو اختبار BLI ، هو قياس التفاعل المحتمل بين بروتين القناة الأيونية hEAG1 المنقى والدهون الجزيئية الصغيرة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأدوية للقناة الأيونية ، مثل ما إذا كان الجزيء الصغير محل الاهتمام يمكن أن يتفاعل مباشرة مع هذه القناة الأيونية وما هي حركية التفاعل؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها طريقة خالية من العمالة وعالية الإنتاجية.

هناك حاجة فقط إلى كمية صغيرة من البروتين الثابت. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن الاختبار الناجح يتضمن خطوات متعددة ، بما في ذلك التعبير عن البروتين ، والتنقية ، ووضع العلامات ، والمستشعر المضبوط بدقة ، وتحليل البيانات. بعد زراعة خلايا HEK293 T المستقرة التي تعبر عن hEAG1 لمدة يومين إلى ثلاثة أيام ، قم بحصاد الخلايا عن طريق إزالة وسط النمو ، واستخدم أربعة ملليلتر من PBS لغسل الخلايا مرتين.

تجاهل PBS. قم بتقسيم الخلايا إلى ملليلترين من PBS لكل طبق ، واستخدم ماصة سعة مليلتر واحد لنقلها إلى الخلايا إلى أنبوب سعة 15 ملليلترا. الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 420 ضعف الجاذبية وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك ، قم بصب المادة الطافية واستخدم أربعة ملليلتر من محلول التحلل لإعادة تعليق الحبيبات. احتضن التعليق على الجليد لمدة 30 دقيقة ، مع دوامة المحللة جيدا كل 10 دقائق. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلية المحللة عند 12،000 مرة من الجاذبية وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب سعة خمسة ملليلتر واحتفظ بها على الجليد للاستخدام الفوري. لتحضير راتنج التقارب المضاد ل FLAG M2 ، قم بتعليق الراتنج تماما عن طريق الانعكاس اللطيف للتأكد من أن زجاجة جل ffinity المضاد ل FLAG M2 عبارة عن تعليق موحد لخرز الجل. انقل 400 ميكرولتر من التعليق على الفور إلى أنبوب مبرد سعة 1.5 مل.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للتعليق عند 8 ، 000 مرة من الجاذبية وأربع درجات مئوية لمدة 30 ثانية ، وتخلص بعناية من المادة الطافية لغسل المخزن المؤقت للتخزين. لإعادة تعليق حبيبات الراتنج ، أضف 500 ميكرولتر من مستخلص البروتين الطافي إلى الراتنج ، وانقل التعليق إلى أنبوب جديد مبرد سعة خمسة ملليلتر. ماصة 500 ميكرولتر إضافية من مستخلص البروتين في الأنبوب الأصلي لجمع أي حبات متبقية ، ونقل المستخلص إلى أنبوب خمسة ملليلتر.

احتضان الخليط على شاكر عند ثمانية دورات في الدقيقة وأربع درجات مئوية طوال الليل لربط بروتين اندماج FLAG بالراتنج. ثم ، قم بالطرد المركزي للخليط عند 1،000 مرة الجاذبية عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية واغسل الحبيبات ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من واحد × PBS.

احتفظ بها على الجليد للاستخدام الفوري. أضف 10 ميكرولترات من ثلاثة × محلول شطف FLAG إلى 390 ميكرولتر من PBS للحصول على تركيز نهائي يبلغ 200 نانوجرام لكل ميكرولتر. بعد ذلك ، أضف 400 ميكرولتر من محلول شطف FLAG بثلاثة × إلى حبات الجل المعدة مسبقا.

احتضان العينة على حاضنة اهتزاز عند ثمانية دورات في الدقيقة وأربع درجات مئوية لمدة ساعتين. ثم ، قم بالطرد المركزي للراتنج عند 8000 مرة من الجاذبية لمدة 30 ثانية. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر ، وقم بتخزينه عند أربع درجات مئوية للاستخدام الفوري.

استخدم مقايسة بروتين BCA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لتحديد تركيز البروتين المنقى. بعد ذلك ، استخدم عينة سعة 30 ميكرولتر لتحليل Western Blot مع جسم مضاد مضاد ل Flag للتأكد من أن البروتين المعني قد تم تنقية. لتسمية البروتين المنقى بالبيوتين ، قم بإعداد خمسة ملليغرام لكل مليلتر من محلول مخزون البيوتين في PBS.

لكل اختبار لاثنين من أجهزة الاستشعار الحيوية ، أضف ثلاثة أضعاف مولار زائدة من البيوتين إلى 20 ميكروغراما من البروتين المنقى لتحقيق البيوتينيل الطرفي N المفضل للبروتين المنقى في PBS. احتضان العينة في الظلام على الجليد لمدة 30 دقيقة على الأقل. لإزالة البيوتين غير المرتبط والمخزن المؤقت ، استبدل البروتين في مخزن SD.

انقل البروتين إلى جهاز ترشيح فائق بقطع جزيئي يبلغ 30 كيلودالتون. بعد ذلك ، أضف المخزن المؤقت SD وقم بالطرد المركزي للعينة عند 12،000 ضعف الجاذبية وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. قم بإزالة الترشيح الفائق من أنبوب الطرد المركزي.

أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت SD إلى جهاز التصفية وقم بالطرد المركزي للعينة مرة أخرى. كرر العملية ثلاث مرات على الأقل. اجمع العينة المتبادلة عن طريق قلب جهاز الترشيح ووضعها في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر.

الطرد المركزي للعينة عند 2,000 مرة الجاذبية وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. احتفظ بالعينة على الثلج للاستخدام الفوري. لإجراء فحص BLI ، قبل 30 دقيقة من الدراسة ، قم بتسخين الجهاز مسبقا عن طريق تشغيل الجهاز.

تحقق من نافذة حالة الجهاز للتأكد من أن الجهاز في حالة جاهزية قبل البدء. تأكد من إغلاق باب الأداة قبل فتح برنامج الحصول على البيانات وفي معالج التجربة ، اختر تجربة الحركية الجديدة. حدد الآبار التي سيتم استخدامها على لوحة البئر 96 بالنقر بزر الماوس الأيمن لاختيار المخزن المؤقت والحمل والعينة.

بالنسبة لعينات الآبار ، يجب إدخال وحدة تركيز PIP2 كأضراس. لتحديد خطوات الفحص ، اختر خطوة ، وانقر نقرا مزدوجا فوق العمود المعني. يتم تعيين نسخة مكررة من تعريف الفحص لأجهزة استشعار التحكم.

اضبط عدد الدورات في الدقيقة على 1,000. اختر دقيقة واحدة لخطوة خط الأساس، وخمس إلى 10 دقائق للتحميل والاقتران والتفكك على التوالي. قم بإجراء الاختبار في درجة حرارة الغرفة.

انقر فوق الأعمدة التي تحتوي على المستشعرات وانقر فوق تعبئة للإشارة إلى موقع المستشعرات في علبة المستشعر. راجع جميع الخطوات المخطط لها للتحقق من الأخطاء والرجوع لتصحيحها. في عملية فحص BLI بأكملها ، يمكن للباحث إهمال خطوة مراجعة جميع الخطوات المخطط لها.

ومع ذلك ، من المهم جدا التحقق من صحة جميع الخطوات المخطط لها. قم بتعيين موقع ملفات البيانات وانقر فوق انتقال لبدء الفحص. قم بتشغيل الفحص وتحليل البيانات وفقا لبروتوكول النص.

كما رأينا في تجربة مشبك التصحيح هذه في خلية HEK293 T ، التي تعبر بثبات عن hEAG1 ، تشير تيارات البوتاسيوم الخارجية المعتمدة على الجهد إلى أن قنوات hEAG1 الوظيفية يتم التعبير عنها بشكل كبير في الخلايا. باستخدام الجسم المضاد المضاد ل FLAG ، تشير هذه اللطخة الغربية من hEAG1 من عينات البروتين المنقى إلى جودة وخصوصية البروتين المنقى. تم إيوتينيل بروتين القناة المنقى لإجراء اختبار تفاعل مع الدهون PIP2 باستخدام مقايسة BLI في الوقت الفعلي.

هنا منحنى ربط نموذجي بين hEAG1 و PIP2. يرتبط hEAG1 ب PIP2 بطريقة تعتمد على التركيز. تتوافق التركيزات المتراكمة ل PIP2 مع آثار بيانات المستشعر الحيوي.

ويبين هذا الاختبار التمثيلي التغيرات في التداخل البصري في تركيزات مختلفة من PIP2. وأخيرا، تم الحصول على منحنى يتناسب مع معادلة هيل من القيمة الذروية لإشارة التداخل البصري المقاسة بتركيزات PIP2 مختلفة وتحديد ثوابت تأين الاتزان بين hEAG1 وPIP2. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في حوالي ساعة واحدة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم جدا أن تتذكر مراجعة جميع الخطوات المخطط لها ، للتأكد من صحة هذا الإجراء. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل مشبك التصحيح من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل تحديد وظيفة هذه القناة الأيونية بعد ربط الجزيء الصغير. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال فحص الترابط للقنوات الأيونية لاستكشاف الروابط الجديدة في اكتشاف أدوية القناة الأيونية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير بروتين القناة الأيونية وكيفية اختبار تفاعله مع الجزيئات الصغيرة ، باستخدام طريقة BLI.