تبلور البروتين ، والحصول على شبكة صلبة من الجزيئات الحيوية ، يوضح بنية البروتين ويتيح دراسة وظيفة البروتين. يتضمن التبلور تجفيف البروتين المنقى تحت مجموعة من العوامل العديدة ، بما في ذلك الأس الهيدروجيني ودرجة الحرارة والقوة الأيونية وتركيز البروتين. بمجرد الحصول على البلورات ، يمكن توضيح بنية البروتين عن طريق حيود الأشعة السينية وحساب نموذج كثافة الإلكترون.
يقدم هذا الفيديو تبلور البروتين ويظهر إجراء عاما. يتم تغطية التعبير عن البروتين وتنقيته والتبلور وحيود الأشعة السينية في الإجراء. تشمل تطبيقات تبلور البروتين في تصميم الدواء ، وتحديد موقع الربط ، وتحليل بنية البروتين الغشائي
تبلور البروتين ، والحصول على شبكة صلبة من الجزيئات الحيوية ، يوضح بنية البروتين ويتيح دراسة وظيفة البروتين. يتضمن التبلور تجفيف البروتين المنقى تحت مجموعة من العوامل العديدة ، بما في ذلك الأس الهيدروجيني ودرجة الحرارة والقوة الأيونية وتركيز البروتين. بمجرد الحصول على البلورات ، يمكن توضيح بنية البروتين عن طريق حيود الأشعة السينية وحساب نموذج كثافة الإلكترون.
يقدم هذا الفيديو تبلور البروتين ويظهر إجراء عاما. يتم تغطية التعبير عن البروتين وتنقيته والتبلور وحيود الأشعة السينية في الإجراء. تشمل تطبيقات تبلور البروتين في تصميم الدواء ، وتحديد موقع الربط ، وتحليل بنية البروتين الغشائي
تبلور البروتين هو عملية الحصول على شكل صلب شبكي من البروتين. هذه البلورات ذات قيمة خاصة لعلماء الأحياء الإنشائية ، مما يساعد في دراسة وظيفة البروتين. يمكن للتقنيات الأخرى ، مثل مواصفات الكتلة أو SDS-PAGE ، توفير معلومات فقط عن الهيكل أحادي البعد للبروتينات. يتم استكمال تبلور البروتين بتقنيات التعبير عن البروتين المؤتلف وحيود الأشعة السينية. سيوضح هذا الفيديو مبادئ تبلور البروتين ، وإجراء مختبري عام ، والعديد من تطبيقاته في المجال الكيميائي الحيوي.
الخطوة الأولى المطلوبة في هذه العملية هي الحصول على كميات مليغرام من البروتين النقي جدا, عادة باستخدام التعبير البروتين المؤتلف. يتم استنساخ الجين المقابل للبروتين محل الاهتمام في ناقل تعبير ، ويتم دمج البروتين المعبر عنه في علامة تقارب ، مثل بولي هيستيدين ، للمساعدة في التنقية عن طريق كروماتوغرافيا التقارب. لمعرفة المزيد ، شاهد فيديو هذه المجموعة حول كروماتوغرافيا التقارب.
يعتمد تكوين البروتين المنقى إلى بلورات على المزيج المناسب للعديد من العوامل ، بما في ذلك الأس الهيدروجيني والقوة الأيونية وتركيزات الترسيب والبروتين ودرجة الحرارة ومعدل التوازن. الطريقة الأكثر شيوعا المستخدمة هي انتشار البخار ، والتي توجد منها فئتان: قطرة معلقة وقطرة جلوس. توجد قطرة تحتوي على بروتين نقي ، ومخزن مؤقت ، وترسيب ، وهي مادة صلبة أيونية تربط جزيئات الماء ، مما يقلل من توافر المياه للبروتين ويحاكي تركيزا أعلى للبروتين ، في بئر صغير مغلق مع خزان به خليط أكثر تركيزا من نفس المخزن المؤقت والراسب في البداية ، تكون تركيزات البروتين والراسب منخفضة جدا بحيث لا تسبب التبلور. أثناء التجربة ، يتبخر الماء من القطرة ويتجمع في الخزان. يؤدي انخفاض كمية الماء في القطرة إلى تشبع النظام ، ويمكن أن يحدث التنوي ، متبوعا بالتبلور. صافي نقل الماء من القطرة في حالة توازن ، ويتم الحفاظ على النظام حتى تكتمل العملية.
لتصور الهيكل ثلاثي الأبعاد ، يتم استخدام حيود الأشعة السينية. للحصول على بيانات الأشعة السينية من البلورة ، يتم وضعها في شعاع أشعة سينية أحادي اللون ، حيث تتعرض للحزمة من جميع الزوايا. يوفر كل تعرض صورة ، حيث تكون كل بقعة عبارة عن أشعة سينية منحرفة ، والتي تخرج من البلورة ويتم تسجيلها بواسطة كاشف. يتم دمج البيانات لإنتاج نموذج لترتيب الذرات داخل البلورة. يوضح الهيكل البلوري الناتج التنسيب ثلاثي الأبعاد للذرات ، بدقة نموذجية تبلغ 2 أنجستروم.
الآن بعد أن غطينا مبادئ تبلور البروتين ، دعونا نلقي نظرة على بروتوكول معمم.
لبدء الإجراء ، يتم تحويل ناقل التعبير الذي يحتوي على الجين محل الاهتمام إلى خلايا. يتم تحضين الخلايا وفي منتصف مرحلة السجل ، يبدأ التعبير عن طريق إضافة محفز ، مثل IPTG ، والذي يؤدي إلى نسخ mRNA للجين. بعد التعبير عن البروتين ، يتم تعليق المادة الخام في محلول التحلل ، ثم يتم توضيحها عن طريق الطرد المركزي.
ثم يتم تحميل المحللة المصفاة على عمود من النيكل ، ويرتبط البروتين الموسوم بالبولي هيستيدين بالعمود بينما يتم غسل جميع الجزيئات الحيوية الأخرى.
بمجرد الحصول على عدة ملليغرامات من البروتين النقي ، يصبح جاهزا للتبلور عن طريق انتشار البخار. تمتلئ صينية إسقاط معلقة / جالسة مكونة من 24 بئرا بتركيزات متفاوتة من محاليل كلوريد الصوديوم وخلات الصوديوم. بالنسبة لطريقة إسقاط الجلوس ، يتم سحب كميات متساوية من البروتين ومحلول الخزان على الرف فوق كل بئر ، ثم يتم تغطية الدرج بشريط شفاف. ثم يتم وضع الدرج في غرفة حضانة ، ويتم مراقبة نمو الآبار في اليوم التالي ، ثم كل بضعة أيام.
بمجرد الحصول على بلورة مناسبة ، تكون جاهزة لتحليل حيود الأشعة السينية. يتم تثبيت البلورة على مقياس الزوايا لوضع البلورة في اتجاهات محددة. تضيء البلورة بشعاع أحادي اللون من الأشعة السينية في جميع الزوايا ، مما ينتج عنه نمط حيود. يقوم البرنامج بتحويل الصور ثنائية الأبعاد ، التي تم التقاطها في اتجاهات مختلفة ، إلى نموذج ثلاثي الأبعاد لكثافة الإلكترونات داخل البلورة عن طريق تحديد مواضع الذرات في البلورة.
الآن بعد أن راجعنا الإجراء ، دعنا نراجع بعض التطبيقات المفيدة لبلورة البروتين ، وتقنية تبلور أخرى.
يمكن استخدام تبلور البروتين في تصميم دواء السيليكو. تم تحديد التركيب ثلاثي الأبعاد لبروتين البوليميراز الأساسي 2 لفيروس الأنفلونزا ، والذي تم ربطه بالعدوى الفيروسية في الثدييات ، عن طريق التبلور وحيود الأشعة السينية. يتم تصور مواقع الربط المحتملة في البروتين ، وباستخدام برنامج الإرساء ، تم تصميم جزيء ثلاثي الأبعاد من شأنه إدخاله في شق في البروتين.
يعد التبلور المشترك لمجمعات البروتين والحمض النووي أيضا تقنية مفيدة. تعدل البروتينات المرتبطة بالحمض النووي مجموعة متنوعة من الوظائف البيولوجية مثل النسخ وبلمرة الحمض النووي وإصلاح الحمض النووي. ويمكن أن توفر الهياكل البلورية لهذه المجمعات نظرة ثاقبة لوظيفة البروتين وآليته وطبيعة التفاعل المحدد. تم تبلور بروتين الإشريكية القولونية SeqA ، وهو منظم سلبي لتكرار الحمض النووي ، مع الحمض النووي الميثيل الثنائي.
يصعب بلورة بروتينات الغشاء المتكاملة مثل المستقبلات المقترنة ببروتين G ، أو GCPRs ، نظرا لمحدوديتها من مساحة السطح القطبية المتاحة لتشكيل ملامسات شبكية بلورية ، مما أدى إلى تطوير تبلور البروتين بمساعدة بروتين الاندماج. تم إدخال الجينات التي تشفر مستقبلات الأدرينالية β2 و GCPR و lysozyme في متجه التعبير. تم تحقيق تبلور بروتين اندماج β2AR- الليزوزيم بسبب زيادة السطح المحب للماء خارج الخلية فوق β2AR الكارهة للماء بشكل طبيعي ، والذي يوفره الليزوزيم ، الضروري لتشكيل تفاعلات التعبئة في الشبكة البلورية.
لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول تبلور البروتين. وصف هذا الفيديو مبادئه ، وبروتوكوله المعمم ، وبعض استخداماته في المجال الطبي الحيوي. شكرا للمشاهدة!
تبلور البروتين ، والحصول على شبكة صلبة من الجزيئات الحيوية ، يوضح بنية البروتين ويتيح دراسة وظيفة البروتين. يتضمن التبلور تجفيف البروتين المنقى تحت مجموعة من العوامل العديدة ، بما في ذلك الأس الهيدروجيني ودرجة الحرارة والقوة الأيونية وتركيز البروتين. بمجرد الحصول على البلورات ، يمكن توضيح بنية البروتين عن طريق حيود الأشعة السينية وحساب نموذج كثافة الإلكترون.
يقدم هذا الفيديو تبلور البروتين ويظهر إجراء عاما. يتم تغطية التعبير عن البروتين وتنقيته والتبلور وحيود الأشعة السينية في الإجراء. تشمل تطبيقات تبلور البروتين في تصميم الدواء ، وتحديد موقع الربط ، وتحليل بنية البروتين الغشائي
تبلور البروتين هو عملية الحصول على شكل صلب شبكي من البروتين. هذه البلورات ذات قيمة خاصة لعلماء الأحياء الإنشائية ، مما يساعد في دراسة وظيفة البروتين. يمكن للتقنيات الأخرى ، مثل مواصفات الكتلة أو SDS-PAGE ، توفير معلومات فقط عن الهيكل أحادي البعد للبروتينات. يتم استكمال تبلور البروتين بتقنيات التعبير عن البروتين المؤتلف وحيود الأشعة السينية. سيوضح هذا الفيديو مبادئ تبلور البروتين ، وإجراء مختبري عام ، والعديد من تطبيقاته في المجال الكيميائي الحيوي.
الخطوة الأولى المطلوبة في هذه العملية هي الحصول على كميات مليغرام من البروتين النقي جدا, عادة باستخدام التعبير البروتين المؤتلف. يتم استنساخ الجين المقابل للبروتين محل الاهتمام في ناقل تعبير ، ويتم دمج البروتين المعبر عنه في علامة تقارب ، مثل بولي هيستيدين ، للمساعدة في التنقية عن طريق كروماتوغرافيا التقارب. لمعرفة المزيد ، شاهد فيديو هذه المجموعة حول كروماتوغرافيا التقارب.
يعتمد تكوين البروتين المنقى إلى بلورات على المزيج المناسب للعديد من العوامل ، بما في ذلك الأس الهيدروجيني والقوة الأيونية وتركيزات الترسيب والبروتين ودرجة الحرارة ومعدل التوازن. الطريقة الأكثر شيوعا المستخدمة هي انتشار البخار ، والتي توجد منها فئتان: قطرة معلقة وقطرة جلوس. توجد قطرة تحتوي على بروتين نقي ، ومخزن مؤقت ، وترسيب ، وهي مادة صلبة أيونية تربط جزيئات الماء ، مما يقلل من توافر المياه للبروتين ويحاكي تركيزا أعلى للبروتين ، في بئر صغير مغلق مع خزان به خليط أكثر تركيزا من نفس المخزن المؤقت والراسب في البداية ، تكون تركيزات البروتين والراسب منخفضة جدا بحيث لا تسبب التبلور. أثناء التجربة ، يتبخر الماء من القطرة ويتجمع في الخزان. يؤدي انخفاض كمية الماء في القطرة إلى تشبع النظام ، ويمكن أن يحدث التنوي ، متبوعا بالتبلور. صافي نقل الماء من القطرة في حالة توازن ، ويتم الحفاظ على النظام حتى تكتمل العملية.
لتصور الهيكل ثلاثي الأبعاد ، يتم استخدام حيود الأشعة السينية. للحصول على بيانات الأشعة السينية من البلورة ، يتم وضعها في شعاع أشعة سينية أحادي اللون ، حيث تتعرض للحزمة من جميع الزوايا. يوفر كل تعرض صورة ، حيث تكون كل بقعة عبارة عن أشعة سينية منحرفة ، والتي تخرج من البلورة ويتم تسجيلها بواسطة كاشف. يتم دمج البيانات لإنتاج نموذج لترتيب الذرات داخل البلورة. يوضح الهيكل البلوري الناتج التنسيب ثلاثي الأبعاد للذرات ، بدقة نموذجية تبلغ 2 أنجستروم.
الآن بعد أن غطينا مبادئ تبلور البروتين ، دعونا نلقي نظرة على بروتوكول معمم.
لبدء الإجراء ، يتم تحويل ناقل التعبير الذي يحتوي على الجين محل الاهتمام إلى خلايا. يتم تحضين الخلايا وفي منتصف مرحلة السجل ، يبدأ التعبير عن طريق إضافة محفز ، مثل IPTG ، والذي يؤدي إلى نسخ mRNA للجين. بعد التعبير عن البروتين ، يتم تعليق المادة الخام في محلول التحلل ، ثم يتم توضيحها عن طريق الطرد المركزي.
ثم يتم تحميل المحللة المصفاة على عمود من النيكل ، ويرتبط البروتين الموسوم بالبولي هيستيدين بالعمود بينما يتم غسل جميع الجزيئات الحيوية الأخرى.
بمجرد الحصول على عدة ملليغرامات من البروتين النقي ، يصبح جاهزا للتبلور عن طريق انتشار البخار. تمتلئ صينية إسقاط معلقة / جالسة مكونة من 24 بئرا بتركيزات متفاوتة من محاليل كلوريد الصوديوم وخلات الصوديوم. بالنسبة لطريقة إسقاط الجلوس ، يتم سحب كميات متساوية من البروتين ومحلول الخزان على الرف فوق كل بئر ، ثم يتم تغطية الدرج بشريط شفاف. ثم يتم وضع الدرج في غرفة حضانة ، ويتم مراقبة نمو الآبار في اليوم التالي ، ثم كل بضعة أيام.
بمجرد الحصول على بلورة مناسبة ، تكون جاهزة لتحليل حيود الأشعة السينية. يتم تثبيت البلورة على مقياس الزوايا لوضع البلورة في اتجاهات محددة. تضيء البلورة بشعاع أحادي اللون من الأشعة السينية في جميع الزوايا ، مما ينتج عنه نمط حيود. يقوم البرنامج بتحويل الصور ثنائية الأبعاد ، التي تم التقاطها في اتجاهات مختلفة ، إلى نموذج ثلاثي الأبعاد لكثافة الإلكترونات داخل البلورة عن طريق تحديد مواضع الذرات في البلورة.
الآن بعد أن راجعنا الإجراء ، دعنا نراجع بعض التطبيقات المفيدة لبلورة البروتين ، وتقنية تبلور أخرى.
يمكن استخدام تبلور البروتين في تصميم دواء السيليكو. تم تحديد التركيب ثلاثي الأبعاد لبروتين البوليميراز الأساسي 2 لفيروس الأنفلونزا ، والذي تم ربطه بالعدوى الفيروسية في الثدييات ، عن طريق التبلور وحيود الأشعة السينية. يتم تصور مواقع الربط المحتملة في البروتين ، وباستخدام برنامج الإرساء ، تم تصميم جزيء ثلاثي الأبعاد من شأنه إدخاله في شق في البروتين.
يعد التبلور المشترك لمجمعات البروتين والحمض النووي أيضا تقنية مفيدة. تعدل البروتينات المرتبطة بالحمض النووي مجموعة متنوعة من الوظائف البيولوجية مثل النسخ وبلمرة الحمض النووي وإصلاح الحمض النووي. ويمكن أن توفر الهياكل البلورية لهذه المجمعات نظرة ثاقبة لوظيفة البروتين وآليته وطبيعة التفاعل المحدد. تم تبلور بروتين الإشريكية القولونية SeqA ، وهو منظم سلبي لتكرار الحمض النووي ، مع الحمض النووي الميثيل الثنائي.
يصعب بلورة بروتينات الغشاء المتكاملة مثل المستقبلات المقترنة ببروتين G ، أو GCPRs ، نظرا لمحدوديتها من مساحة السطح القطبية المتاحة لتشكيل ملامسات شبكية بلورية ، مما أدى إلى تطوير تبلور البروتين بمساعدة بروتين الاندماج. تم إدخال الجينات المشفرة ؟2 مستقبلات الأدرينالية ، و GCPR ، والليزوزيم في ناقل التعبير. تم تحقيق تبلور بروتين اندماج الليزوزيم ?2AR- بسبب زيادة السطح المحب للماء خارج الخلية فوق الكارهة للماء بشكل طبيعي ?2AR ، الذي يوفره الليزوزيم ، الضروري لتشكيل تفاعلات التعبئة في الشبكة البلورية.
لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول تبلور البروتين. وصف هذا الفيديو مبادئه ، وبروتوكوله المعمم ، وبعض استخداماته في المجال الطبي الحيوي. شكرا للمشاهدة!
Chapters in this video
0:00
Overview
0:50
Principles of Protein Crystallization
3:16
Protocol for Protein Expression, Crystallization, and X-Ray Diffraction
5:15
Applications
7:20
Summary
Videos from this collection: