استخدام ألوان جزيء واحد الحنق لدراسة الترابط بين تفاعلات البروتين

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة ديناميكيات أنظمة البروتين المعقدة بطريقة كمية مع التركيز على التفاعلات المترابطة مثل التعاون. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا الكمية حيث تكون مجمعات البروتين وتفاعلاتها الديناميكية ذات أهمية مركزية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتطبيق FRET الجزيئي الديناميكي متعدد الألوان على الأنظمة ذات الصلة بيولوجيا.

قبل تجميع غرفة التدفق ، قم بقطع قناة تدفق في فيلم لاصق شفاف بسمك 40 ميكرون ، ورش مادة لاصقة سريعة التثبيت على الجانب غير اللاصق من الفيلم ، واترك المادة اللاصقة تجف. لبدء تجميع غرفة التدفق ، احصل على شريحة كوارتز منصهرة PEG بسمك ثلاثة ملليمترات مع فتحات مدخل ومخرج. ضع الجانب المطلي بمادة لاصقة بالرش من فيلم السقف على الجانب الوظيفي من الشريحة ، مع محاذاة القناة مع خطافات المدخل والمخرج.

سخني الشريحة إلى 80 درجة مئوية على طبق ساخن لمدة دقيقة واحدة. اضغط على الفيلم على الشريحة لمدة 30 ثانية باستخدام شريحة مجهر إضافية لتوزيع الضغط بالتساوي. ثم اترك التجميع يبرد لمدة دقيقة واحدة.

انزع الورقة الواقية التي تغطي المادة اللاصقة. ضع زلة غطاء على المادة اللاصقة المكشوفة لتشكيل غرفة التدفق. سخني الحجرة إلى 80 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة.

اضغط على زلة الغطاء على المادة اللاصقة لمدة 30 ثانية لإغلاق الغرفة والسماح للغرفة المجمعة بالتبريد. ضع قطرة من الجلسرين على وجه المنشور قبل وضع حجرة التدفق فوق المنشور. قم بتركيب غرفة التدفق في حامل لمجهر TIRF من نوع المنشور متعدد الألوان.

قم بتوصيل أنبوب المدخل والمخرج عند الانتهاء. لبدء تكوين أداة قياس الألوان الثلاثة ، افتح برنامج كاميرا CCD لضرب الإلكترون ، واضبط مستشعر EMCCD على أدنى درجة حرارة ممكنة. اضبط سرعة التحول الرأسي للكاميرا على 3.3 ميكروثانية ، واختر جهد الساعة الرأسي العادي ، واضبط معدل القراءة الأفقي على 17 مللي هرتز عند 16 بت ، وكسب التضخيم المسبق إلى ثلاثة ومستوى كسب مضاعف الإلكترون على 1000.

اختر تشغيل الاستحواذ الخارجي. اضبط وقت التعرض على 70 مللي ثانية. ومدة تسجيل الفيلم إلى 750 دورة اكتساب.

قم بإنشاء مجلد جديد لملفات القياس. قم بتمكين الحفظ التلقائي في برنامج EMCCD وقم بتعيين تنسيق ملف إطار الفيلم على TIFF. قم بتعيين مسار ملف الحفظ التلقائي إلى المجلد الذي تم إنشاؤه حديثا.

ثم افتح البرنامج الذي يتحكم في المرشح القابل للضبط البصري ، وبرنامج التحكم بالليزر ، وبرنامج الزناد الذي يقوم بمزامنة الليزر AOTF ، والمصاريع البصرية ، والكاميرات. استخدم AOTF لضبط طاقة الليزر إلى حوالي ثلاثة مللي واط قبل الدخول إلى المنشور. قم بتحميل نمط التشغيل الذي يقوم بمزامنة جميع الأجهزة لإثارة الليزر المتناوبة ثم قم بتركيب حامل العينة في الجهاز.

ضع نهاية أنبوب المدخل في أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على المخزن المؤقت للتجربة. قم بتوصيل أنبوب المخرج بمضخة حقنة مضبوطة لوضع السحب. اغسل الغرفة ب 150 ميكرولتر من العازلة.

ركز كاميرا CCD على الواجهة الوظيفية ، ومحاذاة حزم الإثارة والملوثات الفلورية المبيضة. ثم قم بتدفق 300 ميكرولتر من محلول 0.25 ملليغرام لكل مليلتر من أفيدين منزوع الغليكوزيلات وقم بتخزينه في الغرفة واحتضانه لمدة دقيقة واحدة. اغسل أفيدين منزوع الغليكوزيلات غير المرتبط من الغرفة باستخدام العازلة.

ثم قم بتدفق 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت بتركيز BSA يبلغ 0.5 ملليغرام لكل مليلتر عبر الغرفة لمنع عيوب وظائف السطح. بعد ذلك ، قم بتحميل غرفة التدفق ب 150 ميكرولتر من أجزاء البيوتينيل المسمى بالفلورسنت Hsp90 في BSA التي تحتوي على مخزن مؤقت عند زيادة تركيزات Hsp90 حتى يتم تحقيق كثافة سطح كافية. اغسل البروتين غير المرتبط من الغرفة ب 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت المحتوي على BSA.

قم بتحميل 150 ميكرولترا من محلول 25 نانومولار من AMP-PMP و BSA المسمى المحتوي على مخزن مؤقت في الغرفة واحتضانه لمدة خمس دقائق. كرر التحميل والحضانة مرة واحدة. ثم استخدم متدرج بيزو لتحريك غرفة العينة بشكل عمودي على شعاع الإثارة لتغيير مجال الرؤية حسب الرغبة.

اضبط تركيز الصورة إذا لزم الأمر. ابدأ تسجيلات الكاميرا في برنامج الكاميرا بالنقر فوق الزر أخذ الإشارة كما هو موضح. ابدأ دورات اكتساب الإثارة في برنامج الزناد لبدء الحصول على البيانات.

لبدء تحليل البيانات ، افتح برنامج التحليل واستورد الأفلام المسجلة للكاميرتين. انقر فوق البحث عن آثار لتحديد آثار شدة التألق المقابلة للجزيئات المفردة المحتملة. لكل جزيء ، احسب مجموع جميع آثار تلك البقعة بنفس لون الإثارة.

قم بتقييم ملامح الشدة في جميع القنوات للحصول على هضبة مسطحة تقريبا في شدة المفصل الخام وخطوة تبييض واحدة لجميع ألوان الإثارة. ابحث عن السلوك المضاد للارتباط في قنوات الكشف المناسبة وحدوث التألق الأحمر في التتبع. إذا تم استيفاء جميع المعايير ، فاحفظ آثار التألق لمزيد من التحليل.

فقط الجزيء المشار إليه يفي بالمعايير الواردة في هذا المثال. استبعاد الآثار التي لا تحتوي على هضاب مسطحة ، والتي تظهر أحداثا وامضة بدلا من مضاد ارتباط أو التي لها خطوات تبييض متعددة. يعد اختيار التتبع خطوة حاسمة في جميع تقنيات الجزيء الفردي.

يجب اختيار الآثار التي تفي بمعايير محددة جيدا فقط. هنا هذه المعايير هي مكافحة الارتباط ، وخطوات التبييض الفردية ، والهضاب المسطحة. بعد ذلك ، اعرض الجزيئات المحفوظة واحدة تلو الأخرى وتحدد مجموعة واحدة من آثار الشدة فاصلا زمنيا يتم فيه تبييض جميع الطوابق الأربعة بالفعل.

احسب شدة خلفية الحزمة لهذا الفاصل الزمني ثم حدد نطاق كفاءة FRET الذي توجد فيه كلتا الأصباغ على Hsp90 مع التأكد من استبعاد الآثار ذات الأحداث الوامضة. احسب آثار التألق الجزئي. استبعاد الجزيئات ذات نسبة الإشارة إلى الضوضاء المنخفضة في الآثار.

بعد ذلك ، قم بإنشاء توقعات ثنائية الأبعاد لبيانات التألق الجزئي وابدأ أداة حساب السكان النسبية. انقر فوق Init. ارسم مضلعا حول ذروة الاهتمام.

وانقر فوق العد لحساب السكان النسبيين لتلك الذروة. قم بإنشاء رسم بياني ثلاثي الأبعاد لبيانات التألق الجزئي وتطبيع الرسم البياني. قم بزيادة المعلمات الأولية لملاءمة 3D Gaussian وأضف مجموعات الحالة إلى نهاية متجه المعلمة.

تناسب البيانات واعرض النتائج. بعد تحديد موضع وعرض كل حالة في مساحة الفلورسنت الجزئية ثلاثية الأبعاد ، قم بتهيئة واجهة Hidden Markov Model. حدد العدد المناسب من الحالات وعدد أبعاد إشارة الإدخال ونوع الإدخال.

تحسين معلمات HMM لتحديد مقدرات الاحتمالية القصوى لاحتمالات الانتقال. كرر تحديد السكان والتركيب وتحسين HMM للمجموعات الفرعية للبيانات. أخيرا ، احسب فاصل الثقة لاحتمالات الانتقال وطي الحالات التوافقية لتبسيط البيانات لمزيد من التحليل.

تمت دراسة الحالات التوافقية لبروتين Hsp90 باستخدام ثلاثة جزيئات أحادية اللون FRET في وجود نيوكليوتيدات المراسل المسمى AMP-PMP. يمكن تمييز خمس حالات توافقية من خلال شدة التألق مع أربع من هذه الحالات متميزة وظيفيا. نتج عن FRET ثلاثي الألوان أحادي الجزيء بيانات التألق الجزئي التي تمتد عبر مساحة ثلاثية الأبعاد.

تم استخدام الإسقاطات ثنائية الأبعاد للمساعدة في فصل الحالات حيث يمكن تمييز جميع الحالات المتوقعة نظريا في ظل ظروف التجربة من خلال الإزهار الجزئي في إسقاطات ثنائية الأبعاد. تم تحديد المجموعات النسبية لهذه الدول من التوقعات ثنائية الأبعاد وتم استخدامها كقيود على نوبات غاوسي ثلاثية الأبعاد. قدم تحسين ونمذجة 3D HMM اللاحقة احتمالات انتقال الحالة المستخرجة.

تم حساب فترات الثقة لكل ثابت معدل مستخرج. أوضح تكرار التجارب في وجود 250 ميكرومولار إضافي غير مسمى AMP-PMP تأثير ارتباط نيوكليوتيدات واحدة على موقع الارتباط الثاني في ثنائي Hsp90. سمح انهيار المطابقات المقيدة وغير المنضمة بحساب متوسط وقت السكون لتفكك AMP-PMP الفلوري من Hsp90 في وجود وعدم وجود AMP-PMP إضافي غير مسمى.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخراج المعلومات الحركية من نظام بروتين ديناميكي باستخدام FRET متعدد الألوان ومجهر TIRF. تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في علوم الحياة لتحديد التفاعلات المترابطة في أنظمة البروتينات المتعددة. هذا مهم لفهم أعمق للآليات التنظيمية الأساسية مثل التعاونية.