وسم الأيضية والتنميط لنقل الكشف باستخدام ماكروارايس

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس المستويات الخلوية لجميع الحمض النووي الريبي المنقول في العينات البيولوجية في وقت واحد من خلال الجمع بين وضع العلامات الأيضية في الجسم الحي مع تحليل المصفوفات الكبيرة. لطالما اعتبرت الحمض النووي الريبي المنقول جزيئات التدبير المنزلي التي تفتقر إلى الوظائف التنظيمية. ومع ذلك ، تشير مجموعة متزايدة من الأدلة إلى أن مستويات الحمض النووي الريبي الخلوي تتقلب استجابة لظروف مختلفة مثل نوع الخلية والبيئة والإجهاد.

يؤثر تذبذب تعبير الحمض النووي الريبي بشكل مباشر على ترجمة الجينات ، ويفضل أو يقمع التعبير عن بروتينات معينة. يتطلب فهم ديناميكيات تخليق البروتين طرقا قادرة على تقديم ملفات تعريف الحمض النووي الريبي عالية الجودة. نقدم هنا تقنية موثوقة ومباشرة تسمح بالقياس الكمي السريع والدقيق لمستويات الحمض النووي الريبي المنقول في الكائنات الحية المزروعة في المختبر.

للبدء ، بإبرة قياس 18 ، ضع ثقبا واحدا في وسط غطاء أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 مليلتر للسماح بالتهوية المناسبة. بعد ذلك ، باستخدام خمسة ميكرولترات من المتفطرة اللطاخة من ثقافة بداية ليلية ، قم بتلقيح 500 ميكرولتر من مرق 7H9 المعقم التكميلي. باتباع ممارسات الحماية الإشعاعية القياسية ، قم بزيادة وسائط الاستزراع ب 20 ميكروكوري لكل مليلتر من أورثوفوسفات المسمى بالفوسفور 32.

تنمو البكتيريا عند 37 درجة مئوية و 1,200 دورة في الدقيقة ، في حاضنة شاكر موضوعة خلف درع أكريليك بسمك تسعة ملليمترات. في مرحلة منتصف المدة ، انقل المزرعة بأكملها إلى أنبوب بغطاء لولبي سعة ملليلتر ، وقم بتقطيع البكتيريا المشعة في درجة حرارة الغرفة عن طريق الطرد المركزي عند 10 ، 000 مرة من الجاذبية لمدة دقيقتين. اجمع المادة الطافية التي تحتوي على أورثوفوسفات مشع غير مدمج في حاوية نفايات مناسبة.

لتحضير الحمض النووي الريبي الكلي ، أضف ملليلترا واحدا من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي التجاري وحوالي 200 ميكرولتر من الخرز الزجاجي إلى الحبيبات. قم بتغطية الأنبوب بإحكام ، وقم بتعطيل البكتيريا في الخالط تحت أقصى قدر من الإثارة لمدة دقيقتين. الطرد المركزي للعينة عند 12،000 مرة الجاذبية وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة ملليلتر ، وتخلص من الخرزات بشكل مناسب. أضف 0.2 مل من الكلوروفورم ، وقم بهز الأنبوب بقوة باليد لمدة 15 ثانية. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 12،000 مرة من الجاذبية وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.

اجمع المرحلة المائية للعينة في أنبوب جديد عن طريق زاوية الأنبوب عند 45 درجة. تجنب رسم أي من الطور البيني أو الطبقة العضوية. أضف ميكرولترين من المرسب الملون و 0.5 مل من الأيزوبروبانول بنسبة 100٪ إلى المرحلة المائية.

هز الأنبوب بقوة باليد لمدة خمس ثوان وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى. قم بإزالة المادة الطافية من الأنبوب ، وتخلص منها بشكل مناسب ، حيث قد يحتوي الجزء السائل على آثار للنشاط الإشعاعي. ثم, بعد تجفيف الحبيبات بالهواء لمدة خمس دقائق, أعد تعليقها في 200 ميكرولتر من 2X SSC مع 0.1٪ الوزن لكل حجم SDS.

باستخدام قاعدة بيانات الحمض النووي الريبي الجينومي ، قم بتصميم مجسات الحمض النووي عن طريق استرداد تسلسلات الحمض النووي الريبي أو جينات ترميز الحمض النووي الريبي أولا. بعد تقليم CCAs المحفوظة ثلاثية الأطراف إذا تم ترميزها وتوليد المكمل العكسي ، اطلب المجسات بناء على أول 70 نيوكليوتيد. لإجراء طباعة المصفوفة ، قم بإذابة اللوحة المكونة من 96 بئرا في درجة حرارة الغرفة.

باستخدام قلم ماسي ، قم بتسمية شرائح زجاجية مطلية بأمين. ثم ضع الشرائح في وحدة فهرسة. بعد مواضع الشبكة ، قم بغمس دبابيس النسخ المتماثل بعناية في الآبار.

باستخدام الحد الأدنى من الضغط ، قم بطباعة المصفوفة برفق على الشرائح الزجاجية. استمر في الطباعة دون تنظيف المصفوفة حتى تنتهي من A.It يتطلب بعض الممارسة لتتمكن من الطباعة باستمرار. نوصي بطباعة ما لا يزيد عن ثمانية إلى 10 صفيفات في كل جلسة.

عد من 10 إلى 15 دقيقة لكل صفيف. من السهل أن تفقد مسار تسلسل نمط الطباعة ، لذا خصص انتباهك بالكامل للمهمة وقم بإيقاف تشغيل جميع الانحرافات. عندما تكون جاهزا للانتقال إلى الكتلة التالية ، اغمس النسخ المتماثل في 5٪ مبيض ورجها برفق.

اضغط على النسخ المتماثل في ورق ماص. ثم اغمس المكرر في الماء المقطر ، ورجه برفق ، واضغط على الورق. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.

بعد ذلك ، اغمس النسخ المتماثل في الأيزوبروبانول ، ورجه برفق ، واضغط عليه في الورق. جفف النسخ المتماثل على المروحة لمدة 20 ثانية تقريبا قبل الانتقال إلى الكتلة التالية من اللوحة المكونة من 96 بئرا. تابع إلى العدد المطلوب من المطبوعات.

ثم اترك الشرائح تجف. ضع الشرائح المجففة ووجهها لأعلى على سطح نظيف في وصلة متشابكة للأشعة فوق البنفسجية 254 نانومتر. اضبط مستوى الطاقة على 999 ، 990 ميكروجول لكل سنتيمتر مربع ، ثم اضغط على ابدأ.

انقل المصفوفات إلى 450 مل من محلول المنع ، واحتضنها في درجة حرارة الغرفة على محرك مغناطيسي ، تحت التحريك البطيء بين عشية وضحاها. اغسل الشرائح في 500 مل من الماء المقطر في درجة حرارة الغرفة ، مرتين لمدة خمس دقائق لكل منهما. جفف الشرائح عن طريق الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي دقيق في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 ثوان.

قم بتخزين المصفوفات في مكان جاف ومظلم لمدة تصل إلى ستة أشهر. قبل التهجين ، اشطف الشرائح بالماء المغلي وجففها بالطرد المركزي. ضع المصفوفة داخل شريط تهجين ، وقم بتحميل عينة الحمض النووي الريبي ذات العلامات الراديوية.

قم بتشغيل العينات على محطة غسيل التهجين الآلي لتحقيق أقصى قدر من القابلية للتكرار وفقا لبروتوكول النص. في نهاية الجري ، جفف الشرائح عن طريق الطرد المركزي. لف الشرائح بالبلاستيك الرقيق.

بعد ذلك ، استخدم عداد جيجر في إعداده الأكثر حساسية للتحقق من الشرائح بحثا عن إشارة مشعة. قم بتعريض الشرائح على شاشة فوسفور للتخزين في شريط تعريض ضوئي في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 90 ساعة حسب قوة الإشارة. يعتمد وقت التعرض الذي يمكن أن يستمر من بضع ساعات إلى بضعة أيام بشكل مباشر على إشارة المصفوفة.

يتطلب الأمر بعض الممارسة لتتمكن من ترجمة التهم على عداد جيجر إلى وقت التعرض. امسح الشريحة بدقة 50 ميكرومتر باستخدام فوسفوريجر. قم بتحديد كثافة النشاط الإشعاعي وطرحها في الخلفية في كل بقعة مسبار باستخدام برنامج ImageJ المجاني الذي تمت ترقيته باستخدام ملف تعريف المصفوفة الدقيقة.

قم بإنشاء خرائط حرارية وفقا لبروتوكول النص. كما هو موضح هنا ، المصفوفات الكبيرة البكتيرية والماوس والبشري الممسوحة ضوئيا. تستخدم مصفوفات M.smegmatis 43 مجسا فقط بدلا من 48 مجسا يستخدم للفأر والإنسان.

نتيجة لذلك ، تعرض المصفوفة البكتيرية 40 بقعة فارغة تمتزج مع الخلفية. تظهر ثلاثة مكررات بيولوجية مستقلة أنه في ظل ظروف النمو المختبرة ، يتم التعبير عن جميع M.smegmatis tRNAs فوق مستوى الخلفية. في هذه التجربة بالذات ، يتراوح الانحراف المعياري الملحوظ لكل مسبار بين 2٪ Arginine TCT و 22٪ Cysteine GCA مع متوسط عند 5٪ بالإضافة إلى ذلك ، تظهر هذه التجربة أن التعبير عن متوافقات الحمض النووي الريبي المرسال ليس موحدا.

على سبيل المثال ، يتم التعبير عن جميع متوافقات الألانين بمستويات متشابهة ، في حين أن أعلى وأدنى أرجينين يقبل tRNAs يختلف بثلاثة أضعاف. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في حوالي 24 ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح وإذا كانت الإشارة الموضعية كافية. طريقتنا قابلة للتطبيق على أي كائنات حية يتوفر جينومها لتصميم المسبار.

الكائنات الحية النموذجية التي تزرع في المختبر هي مرشحة مثالية لوضع العلامات الأيضية. تم تحسين البروتوكول المقدم هنا ل Mycobacterium smegmatis ، ولكن تم استخدامه أيضا بنجاح لتوصيف الحمض النووي الريبي في الإشريكية القولونية والخميرة والفئران والخلايا المستنبتة البشرية. تقنيتنا قابلة للتكرار ومحددة.

يسمح نطاقه الديناميكي الكبير وعتبة التعديل بسهولة بتنميط الأنواع المنخفضة الوفرة ، مثل الحمض النووي الريبي المرسال المرتبط بالبوليسومات ، ببساطة عن طريق إطالة أوقات التعرض للمصفوف.