الجمع بين تناول الطعام الكمية فحوصات وتنشيط الخلايا العصبية لدراسة الشهية في المورفولوجية قسراً

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس كمية تناول الطعام من ذبابة الفاكهة البالغة ، مما يوفر وسيلة لتقييم آثار التلاعب الجيني مثل التنشيط المولين الحراري والبصري للخلايا العصبية. يمكن أن تساعد هذه التدابير في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التغذية ، مثل الميكانيكا العصبية للجوع والشبع والشهية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تحدد في نفس الوقت كمية تناول الطعام لمجموعات متعددة من الذباب ، مما يجعلها مفيدة بشكل خاص لتحديد الذباب الذي يتغذى بشكل غير طبيعي في الشاشات الجينية.

لتبدأ جمع الإمدادات لإعداد الحاوية الخارجية. 0.5 جرام من الاغاروز و 50 مل من الماء المقطر المزدوج. يسخن مع التحريك المتكرر ، ويغلى ليذوب تماما على محرك مغناطيسي مع لوح حراري.

عندما يبرد 1٪ agarose إلى حوالي 60 درجة مئوية ، انقل خمسة ملليلتر إلى حاوية خارجية فارغة واحتفف بالحاوية مفتوحة حتى يبرد الاغاروز إلى درجة حرارة الغرفة لإنتاج وسادة الاغاروز. بعد ذلك ، أضف 0.5 جرام من الاغاروز إلى 50 مل من الماء المقطر المزدوج. يسخن مع التحريك المتكرر ويغلي ليذوب تماما على محرك مغناطيسي مع لوح حراري.

عندما يبرد 1٪ agarose إلى حوالي 60 درجة مئوية ، أضف 1.71 جرام من السكروز إلى الاغاروز للحصول على 100 ملليمول من السكروز. أضف 0.25 جرام من الصبغة الزرقاء إلى محلول الاغاروز للحصول على 0.5٪ من الوزن لكل حجم مصبوغ بالطعام المسمى بعلامة ثم تحضير الحاوية الداخلية.

ضع الحاويات الداخلية الفارغة على سطح أفقي مستو. ثم أضف 750 ميكرولتر من الطعام المصنف بالصبغة الزرقاء إلى حاويات الطعام الفردية. اتركه يتماسك لمدة خمس دقائق على الأقل.

انقل حاوية داخلية مملوءة إلى حاوية خارجية معدة وضعها في وسط وسادة الاغاروز. قم بإعداد غرف التغذية بالطعام الخالي من الصبغة لطرح الخلفية. اترك غرف التغذية مفتوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة ، حتى يصبح جدار الحاوية الخارجية خاليا من التكثيف.

قبل التجارب السلوكية ، قم بموازنة غرف التغذية المحضرة عند درجة حرارة تجريبية تبلغ 30 درجة مئوية لمدة ساعتين للتأكد من أن درجة الحرارة موحدة نسبيا في غرف التغذية. لبدء عملية التغذية ، انقل 20 ذبابة بعناية من قارورة منزلهم إلى غرفة تغذية مسخنة مسبقا عن طريق النقر اللطيف. استمر في عملية التغذية عند 30 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.

توقف عن التغذية عن طريق تجميد غرف التغذية عند سالب 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. انقل 20 ذبابة بعناية من قارورة واحدة إلى غرفة التغذية عن طريق النقر اللطيف. ثم ضع الغرفة جانبيا على إعداد الإضاءة.

للتلاعب البصري الوراثي ، استخدم مجموعة من مصابيح LED البرتقالية كمصدر لتحفيز الضوء ، وقم بتثبيت لوحة زجاجية أفقية فوق مصابيح LED لدعم غرف التغذية أثناء الإضاءة. احتفظ بالإعداد في حاضنة عند 25 درجة مئوية مع رطوبة 60٪. تحفيز ذباب التحكم الجيني بالتوازي مع ذباب Taotie-GAL4 UAS CsChrimson ، ولكن في غرف تغذية مختلفة.

استمر في عملية التغذية لمدة 60 دقيقة مع الإضاءة الخلفية بالضوء البرتقالي. ثم قم بتجميد غرف التغذية عند سالب 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد التوقف عن التغذية ، اسكب كل 20 ذبابا من غرفة التغذية على قطعة من ورق الوزن.

ثم انقلها إلى أنبوب سعة 1.5 مليلتر باستخدام فرشاة ناعمة. أضف 500 ميكرولتر من PBST إلى الأنبوب وقم بتجانس الذباب باستخدام مطحنة طحن عند 60 هرتز لمدة خمس ثوان. ثم تأكد من التجانس الكافي عن طريق الملاحظة عندما لا تكون هناك شظايا يمكن اكتشافها من أجزاء الجسم.

قم بتدوير الأنابيب مع المتجانسات لمدة 30 دقيقة عند 1300 دورة في الدقيقة لإزالة الحطام. بعد الطرد المركزي ، انقل 100 ميكرولتر من المادة الطافية إلى بئر من 96 لوحة بئر. لتجنب سوء تقدير المواد الماصة التي يسببها الحطام ، أخرج الأنبوب المستخدم برفق من جهاز الطرد المركزي وقم بإسقاط المادة الطافية بعناية دون إزعاج البليت.

بعد تحميل جميع العينات ، ضع اللوحة في قارئ الألواح لقياس المواد الماصة للعينات عند 630 نانومتر. تم تحديد استجابة التغذية عن طريق الفحص البصري وتسجيل الذباب بصبغة يمكن اكتشافها في القناة الهضمية. بعد تنشيط الخلايا العصبية Taotie ، أظهر حوالي 58٪ من ذباب Taotie dTRPA1 سلوكيات تغذية قوية.

و 23٪ من هؤلاء أظهروا سلوكيات تغذية خفيفة. أدت الخلايا العصبية Taotie-GAL4 المنشطة الحادة بواسطة TRPA1 إلى زيادة تناول الطعام بشكل كبير ، مما يشير إلى أن الخلايا العصبية المسماة Taotie-GAL4 تشارك في تنظيم تناول الطعام لذبابة الفاكهة البالغة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد كمية الطعام التي يتم تناولها بعد التلاعب بنشاط الخلايا العصبية للتحقيق في الآليات العصبية للتحكم في التغذية لدى ذبابة الفاكهة السوداء البالغة.