بروتوكول لإنتاج ناقلات لينتيفيرال إينتيجراسي التي تفتقر لخروج المغلوب كريسبر/Cas9-بوساطة الجينات في تقسيم الخلايا

الهدف العام من هذا البروتوكول هو وصف إنتاج والتطبيقات المحتملة للنواقل اللنتيفيروسية المحسنة والناقصة الإنتيغريز (integrase-deficient lentiviral vectors)، والقادرة على إيصال الجينات المنقولة لـ CRISPR/Cas9 إلى الخلايا داخل الجسم (in vivo) وخارجه (in vitro) من أجل تحرير جيني سريع وفعال. وتعد تقنية CRISPR/Cas منصة عالية الكفاءة لتحرير الجينات ومعالجتها. وفيما يلي مخطط لبروتوكول إنتاج نواقل لنتيفيروسية محسنة وناقصة الإنتيغريز عالية التركيز، لضمان الإيصال الفعال لأدوات تحرير الجينات CRISPR/Cas.

لقد أثبتت هذه التقنية كفاءة عالية في الخلايا المستنبتة والعصبونات ما بعد الانقسام الفتيلي. قم باستزراع خلايا HEK-293T قبل يوم واحد من عملية عفن الخلية (transfection) بحيث تصل نسبة التلاقي (confluency) إلى ما بين 70 إلى 80% في اليوم التالي. وقبل البدء بعملية عفن الخلية، قم بسحب الوسط الغذائي القديم من أطباق الاستزراع وأضف وسطاً غذائياً مُحضراً حديثاً وخالياً من المصل.

في أنبوب مخروطي سعة 15 ميليلتر، أضف البلازميدات الأربعة جميعها لتحضير مزيج بلازميدي لترانسفكشن طبق قطر 15 سنتيمتر. بعد ذلك، أضف 312.5 ميكرولتر من كلوريد الكالسيوم بتركيز 1 مولار إلى مزيج البلازميد واضبط الحجم ليصل إلى 1.25 ميليلتر باستخدام ماء مقطر مزدوج معقم. استمر في إضافة قطرات من محلول BES المنظم بتركيز 2X تدريجياً مع الرج باستخدام جهاز الفورتيكس.

وبعد ذلك، تُحضن المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. أضف 2.5 milliliters من مزيج البلازميد على شكل قطرات إلى كل طبق من الأطباق ذات قطر 15-centimeter. ثم، قم بتدوير الأطباق برفق وحضنها عند 37 درجة Celsius مع 5% carbon dioxide لمدة تتراوح بين ساعتين إلى ثلاث ساعات.

بعد ثلاث ساعات، أضف 2.5 milliliters من السيروم بتركيز 10% إلى كل طبق وواصل التحضين طوال الليل. استخدم ماصة زراعة أنسجة سعة 10-milliliter لسحب السائل الطافي بعناية من الخلايا المنقولة والمستزرعة في كل طبق زراعة. بعد ذلك، اجمع كامل السائل الطافي في أنابيب طرد مركزي سعة 50-milliliter.

ضع الأنبوب داخل جهاز طرد مركزي مكتبي وابدأ عملية الطرد المركزي. بعد ذلك، قم بترشيح السائل الطافي عبر وحدة ترشيح تفريغ بمسامية 0.45-micrometer. املأ أنابيب الطرد المركزي الفائق المخروطية بتركيزات مختلفة من السكروز لتكوين طبقات ذات تدرج سكروزي.

أضف الطافي المحتوي على الفيروس بعناية إلى تدرج السكروز. ولمعالجة الحجم الكامل من الطافي الفيروسي البالغ 100 mL، استخدم ست أنابيب طرد مركزي فائق في كل دورة. بعد ذلك، وازن أنابيب الطرد المركزي الفائق باستخدام منظم PBS بتركيز 1X، وقم بتدوير العينات عند 70,000 g لمدة ساعتين عند 17 °C.

في أنابيب نظيفة، اجمع أجزاء السكروز بتركيز 30% و60% وأضف محلول 1X PBS المنظم البارد لضبط الحجم إلى 100 milliliters. امزج العينات عن طريق السحب والطرد باستخدام الماصة عدة مرات. بعد ذلك، أضف من 20 إلى 25 milliliters من المحلول الفيروسي فوق أربعة milliliters من السكروز بتركيز 20% في محلول 1X PBS لتحضير وسادة السكروز.

اضبط الحجم باستخدام محلول PBS المنظم 1X المعقم إذا كانت الأنابيب ممتلئة بأقل من 3/4 سعتها ثم قم بموازنتها. بعد ذلك، قم بطرد العينات مركزياً لمدة ساعتين عند 17 درجة Celsius. ثم، اسكب السائل الطافي وصرف السائل المتبقي عن طريق قلب الأنابيب على مناشف ورقية.

بعد سحب آخر القطرات المتبقية، تظهر كتلة تحتوي على الفيروس بالكاد على شكل بقعة شفافة. بعد ذلك، أعد تعليق الكتلة في 70 µL من 1X PBS عن طريق سحب المعلق بالماصة بشكل جيد. مرة أخرى، انقل المعلق إلى أنبوب آخر واخلطه جيداً لإذابة الكتلة تماماً.

بعد ذلك، اشطف الأنبوب بـ 50 µL إضافية من محلول 1X PBS المنظم البارد وامزجهما. ضع العينات في جهاز طرد مركزي دقيق مكتبي وقم بطردها مركزياً عند 10,000 g لمدة 30 ثانية. بعد الطرد المركزي، أضف حصصاً بمقدار 10 µL من السائل الطافي إلى كل أنبوب طرد مركزي دقيق جديد وخزنها عند -80 °C.

قم بطلاء لوحة ذات 96 بئراً عالية الارتباط بـ 100 µL من الجسم المضاد أحادي النسيلة anti-p24 بتخفيف قدره 1:1,500 وفقاً لبرنامج لقاح الإيدز التابع للمعاهد الوطنية للصحة (NIH) الخاص بطقم مقايسة التقاط مستضد HIV-1 p24. تُحضن اللوحة طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. وفي اليوم التالي، تُغسل اللوحة بـ 200 µL من 0.05%TWEEN-20 في محلول PBS بارد ثلاث مرات.

لتجنب الارتباط غير النوعي، يتم حجب اللوحة باستخدام 200 µL من bovine serum albumin بتركيز 1% لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، تُغسل اللوحة بـ 200 µL من TWEEN-20 بتركيز 0.05% في PBS بارد ثلاث مرات. ثم، يتم تحضير عينات الناقل المركزة وغير المركزة بتركيز نهائي قدره 10% عن طريق تخفيف الناقل باستخدام الماء المقطر مرتين وTriton X-100.

بعد ذلك، يتم تحضير معايير HIV-1 باستخدام التخفيف التسلسلي بمقدار ضعفين بدءاً من 5 ng/mL. وبعد تخفيف عينات الناقل المركزة وغير المركزة، تُنقل الماصة إلى الطبق في ثلاث مكررات وتُحضن عند 4 °C طوال الليل. وفي اليوم التالي، تُغسل اللوحة، ثم يُضاف 100 µL من الأجسام المضادة متعددة النسائل للأرنب anti-p24 إلى كل لوحة وتُحضن عند 37 °C لمدة أربع ساعات.

بعد ست غسلات، يتم تحضين اللوحة باستخدام الجسم المضاد الماعزي المضاد للأرنب المرتبط بإنزيم بيروكسيداز الفجل (goat anti-rabbit horseradish peroxidase) عند 37 °C لمدة ساعة واحدة. وبعد عدة غسلات، يتم تحضين اللوحة مع مادة TMB peroxidase substrate في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. ثم يُضاف حمض الهيدروكلوريك العادي لإيقاف التفاعل. وأخيراً، يتم قياس الامتصاصية عند 450 nanometers باستخدام قارئ ألواح الامتصاصية.

قم باستزراع الخلايا في طبق سداسي الفجوات. وفي اليوم التالي، عندما تصل الخلايا إلى نسبة تلاحم 90%، قم بنقل الجينات باستخدام الفيروس المنقى بمضاعفة عدوى محددة مسبقاً تتراوح من 1 إلى 10.

بعد ذلك، يتم تحضين الطبق عند 37 درجة مئوية مع 5% ثاني أكسيد الكربون. وتتم مراقبة الأطباق لتسجيل الاختلاف في إشارات GFP على فترات زمنية منتظمة لمدة تتراوح من يوم واحد إلى سبعة أيام. يتم البحث عن الخلايا الموجبة لـ GFP باستخدام مجهر فلوري مزود بمجموعة مرشحات GFP بأطوال موجية للإثارة والانبعاث تبلغ 470 و 525 نانومتر على التوالي.

للتمييز بين مجموعة الخلايا الموجبة والسالبة لـ GFP، استخدم خلايا غير محولة. يظهر جل الأغاروز التمثيلي مستنسخ الإنترغيز الطافر الموجب. يمثل المستنسخ الذي خضع للهضم المزدوج باستخدام إنزيمات القطع EcoRV و SPH1 في المربع المتقطع الأحمر مستنسخ الإنترغيز الطافر.

تم إجراء تسلسل إضافي للمستنسخ للتحقق من طفرة حمض الأسبارتيك في الموضع 64 إلى حمض الجلوتاميك. يوضح الرسم البياني الشريطي النموذجي لمقايسة p24 ELISA عيارات الفيروس للناقل اللينتي فيروسي CRISPR/Cas9 الناقص في الإنتيجريز SP1 الممثلة بالشريط الأسود، والناقلات اللينتي فيروسية CRISPR/Cas9 القادرة على التكامل SP1 الممثلة بالشريط الأبيض. يظهر الرسم البياني الشريطي عيارات الفيروس الناقصة والقادرة على التكامل في نطاق 1 × 10. وتمثل الرسوم البيانية الشريطية عدد نسخ الجسيمات الفيروسية لكل milliliter.

صور فلورية تمثيلية توضح متوسط شدة الفلورة للخلايا الموجبة لـ GFP تحت تأثير المعالجة الفيروسية. تم نقل المكونات الفيروسية لـ CRISPR عبر ناقلات فيروسية لينتية قادرة على التكامل أو ناقلات فيروسية لينتية ناقصة الإنتيجريز.

لُوحظ انخفاض حاد في إشارة GFP عند تعددية عدوى بلغت 1 و5 على التوالي بعد نقل المكونات الفيروسية البطيئة المتمتعة بكفاءة الإنتيجريز أو المفتقرة إليه، مقارنة بالخلايا الضابطة غير المنقولة. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في قدرة النواقل الفيروسية البطيئة المفتقرة للإنتيجريز على نقل أداة تحرير الجينوم بشكل مؤقت، مما يعزز بشكل كبير من خصوصيتها وسلامتها. وفي حال تنفيذها بشكل صحيح، يجب أن تستغرق البروتوكولات أسبوعاً واحداً لإتمامها.

عند تنفيذ هذا البروتوكول، من المتوقع إنتاج ناقلات فيروسية بطيئة (lentiviral vectors) عالية التركيز تتراوح بين 10⁹ و10¹⁰ نسخة من الجينوم الفيروسي لكل mL.