برنامج متكامل لرسم خرائط الجينوم على نطاق الدول الكروماتين استخدام رقاقة الفائق-التسلسل في أنسجة الورم

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تحديد أنماط حالة الكروماتين الاندماجية بشكل غير متحيز في أنسجة الورم وخطوط الخلايا السرطانية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم التخلق السرطاني مثل كيف يمكن أن تساهم حالات تعديل الهيستون القاحلة في تكوين الورم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن معالجة تعديلات هيستون المتعددة ، بالإضافة إلى عينات متعددة في وقت واحد ، وكذلك بكفاءة.

أولا ، قم بفصل 50 ملليغرام من أنسجة الورم الميلانيني يدويا ومليلترين من محلول الملح المتوازن من Hank أو HBSS ، باستخدام شفرة حلاقة معقمة. افرم الأنسجة إلى ثلاث أو أربعة مليمترات لمدة خمس دقائق تقريبا في طبق زراعة أنسجة معقمة. انقل محلول الأنسجة إلى أنبوب انفصال وأضف ثماني ملليلتر آخر من HBSS.

قم بفصل الأنسجة باستخدام مفكك حتى يتجانس. بعد ذلك ، قم بربط الأنسجة ، مع إضافة 200 ميكرولتر من 16٪ فورمالديهايد لكل ثلاثة ملليلتر من HBSS. باستخدام الخلاط ، رج الخليط على حرارة 10 دورات في الدقيقة لمدة 10 دقائق بالضبط عند 37 درجة مئوية.

بعد إزالة العينة من الحاضنة ، أضف 200 ميكرولتر من الجلايسين الورمي لكل ثلاثة ملليلتر من العينة ورج الخليط عند 10 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. قم بتدوير العينة عند 934 مرة جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية باستخدام جهاز طرد مركزي أعلى مقاعد البدلاء. عند الانتهاء ، قم بإزالة المادة الطافية وأضف خمسة ملليلتر من PBS المثلج.

ثم ، قم بالطرد المركزي للعينة مرة أخرى عند 934 مرة جم ثم قم بإزالة المادة الطافية. أضف 300 ميكرولتر من مخزن حصاد ChIP مع مثبطات البروتياز لكل 50 ملليغرام من الأنسجة وقم بتحليل العينات لمدة 30 دقيقة على الثلج. أثناء تحلل الخلايا ، قم بتشغيل معطل الحمام المائي ونظام التبريد المرتبط به واترك درجة الحرارة تصل إلى أربع درجات مئوية.

ضع أنبوب الصوتنة في الحمام المائي المعطل وصوتنة أنسجة الورم الميلانيني لمدة 60 دورة في 30 ثانية و 30 ثانية للحصول على شظايا كروماتين من 200 إلى 600 زوج قاعدة. بالنسبة لثمانية ملليغرامات من أنسجة الورم الميلانيني ، احتضن ثلاثة ميكروغرامات من كل جسم مضاد هيستون مع 20 ميكرولترا من الخرز المغناطيسي للبروتين g و 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لمنع الربط لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية مع الدوران ، باستخدام مسدس أنبوبي. بعد الصوتنة ، قم بتخفيف العينة خمس مرات باستخدام المخزن المؤقت لتخفيف ChIP لخفض تركيز SDS إلى 0.1٪ بعد اكتمال حضانة الجسم المضاد والخرز المغناطيسي البروتين g ، قم بإزالة المخزن المؤقت لتخفيف ChIP وأعد تعليق الخرز في 240 ميكرولتر من المخزن المؤقت الجديد.

بعد ذلك ، ضع 20 ميكرولترا من الخرزات في 12 أنبوبا منفصلا ، سيتم استخدام كل منها لعينة منفصلة من الأنسجة. Aliquot المواد صوتنة بالتساوي مع حبات البروتين g مع الجسم المضاد المحدد وتدوير الأنابيب باستخدام مسدس أنبوبي بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. في صباح اليوم التالي للربط المتقاطع العكسي ، انقل محلول بروتين الجسم المضاد إلى صفيحة 96 جيدا وضعها على حامل مغناطيسي.

بعد السماح للحبات بالالتصاق لمدة 30 ثانية على الأقل ، قم بإزالة المادة الطافية. اغسل الخرزات خمس مرات باستخدام 150 ميكرولتر من محلول غسيل RIPA المثلج البارد باستخدام ماصة متعددة القنوات. حرك المغناطيس باستمرار لمدة 30 ثانية لكل غسلة ، ثم قم بإزالة المادة الطافية.

بعد خطوات الغسيل ، أضف مزيجا رئيسيا للعازلة للشطف ، يحتوي على 44 ميكرولتر من مخزن الشطف المباشر ، وميكرولتر واحد من Rnase وخمسة ميكرولترات من البروتيناز k لكل شريحة وأدخل العينة للربط المتقاطع العكسي. احتضان العينات باستخدام جهاز تدوير حراري PCR لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية وأربع ساعات عند 50 درجة مئوية وثماني إلى 16 ساعة عند 65 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي ، ضع العينات مرة أخرى على المغناطيس وانقل المادة الطافية إلى لوحة PCR جديدة 96 بئر تحتوي على الحمض النووي المترسب الأميني.

أضف 2.3 × حبات مغناطيسية إلى المحلول وقم بسحب الماصة بعناية لأعلى ولأسفل 25 مرة باستخدام ماصة متعددة القنوات. بعد ذلك ، احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع دقائق. ثم ضع العينات مرة أخرى على المغناطيس واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع دقائق أخرى.

بعد التخلص من المادة الطافية ، أضف 150 ميكرولترا من الإيثانول بنسبة 70٪ إلى العينات واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية دون إزعاج الخرز. بعد السماح للحبات بالجفاف ، قم بإزالة العينات من المغناطيس وأضف 30 ميكرولترا من 10 ملليمولار. تخلط عن طريق سحب العينات 25 مرة.

بعد احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة ، ضعها مرة أخرى على المغناطيس واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع دقائق أخرى. انقل 20 ميكرولترا من كل عينة إلى لوحة جديدة سعة 96 بئر لإعداد المكتبة. بعد تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بإزالة العينات ورفع الحجم الإجمالي إلى 100 ميكرولتر باستخدام الماء الخالي من النواة.

قم بإجراء اختيار الحجم المغناطيسي على الوجهين عن طريق إضافة 55 ميكرولترا من الخرز أولا إلى كل عينة وخلطها 25 مرة باستخدام ماصة. ثم احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع دقائق. ضع العينات مرة أخرى على المغناطيس واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع دقائق أخرى للحصول على شظايا كبيرة على الخرز غير المناسب للتسلسل.

بعد الحضانة ، انقل المادة الطافية إلى لوحة PCR جديدة سعة 96 بئر. أضف 25 ميكرولترا أخرى من الخرز المغناطيسي واخلطه عن طريق سحب العينات 25 مرة واحتضانه في درجة حرارة الغرفة بعيدا عن المغناطيس لمدة أربع دقائق. بعد الحضانة في درجة حرارة الغرفة ، ضع العينات مرة أخرى على المغناطيس واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع دقائق.

ثم تخلص من الطافف. أثناء ترك العينات على المغناطيس ، أضف 150 ميكرولترا من الإيثانول بنسبة 70٪ واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية دون إزعاج الخرز. قم بإزالة الإيثانول وكرر الغسيل.

بعد ترك الخرزات تجف ، قم بإزالة العينات من المغناطيس وأضف 25 ميكرولترا من 10 مللي مولار درجة الحموضة النزرية 8.0. امزج عن طريق سحب العينات 25 مرة واحتضنه في درجة حرارة الغرفة ، بعيدا عن المغناطيس لمدة أربع دقائق. بعد الحضانة في درجة حرارة الغرفة ، ضع العينات مرة أخرى على المغناطيس واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع دقائق.

الآن ، قم بتحديد كمية المكتبات باستخدام أداة مخطط كهربية الحمض النووي عالية الحساسية قبل تعدد الإرسال للتأكد من أن الأحجام مناسبة للتسلسل. يسمح هذا البروتوكول بالترسيب المناعي لأنسجة الورم المجمدة وخطوط الخلايا التي يمكن إجراؤها على عشرات العينات وبالتوازي باستخدام طريقة إنتاجية عالية. يجب أن تتراوح شظايا الكروماتين بين 200 و 1000 زوج أساسي للحصول على الترسيب المناعي الأمثل.

يجب تحديد الحمض النووي المنقى ChIP قبل الشروع في إعداد المكتبة. وينبغي أن تتراوح المكتبات المكتملة المناسبة لتعدد الإرسال وتسلسل الجيل التالي بين 200 و600 زوج أساسي وأن تكون خالية من أي ثنائيات أولية. عند التسلسل اللاحق ، هناك العديد من مقاييس مراقبة الجودة التي يجب الوفاء بها قبل المتابعة إلى خطوات أخرى لخط الأنابيب ، مثل استدعاء ذروة أجهزة Mac وتحليل chromHmm.

يجب إثراء عينات ChIP على الحمض النووي المدخل ويجب أن يعرض كل تعديل هيستون مظهرا مميزا يمثل مكونا محددا من المشهد اللاجيني. تستخدم خوارزمية الكروم HMM نموذج ماركوف المخفي متعدد المتغيرات لتحديد أبرز أنماط الكروماتين الاندماجية والمكانية المتكررة بناء على تعديلات الهيستون المدروسة. باستخدام هذه التعديلات الستة ، يحدد chrome HMM حالات الكروماتين المتميزة وظيفيا التي تمثل كلا من المجالات القمعية والنشطة ، مثل قمع متعدد الأرشيط ، والقمع غير المتجانس ، والنسخ النشط ، والمعززات النشطة.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ثلاثة إلى أربعة أيام ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم تحديد ظروف الصوتنة المثلى ومواصفات الأجسام المضادة قبل الاستمرار في إعداد المكتبة وتحليل البيانات. لتعلم هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل تسلسل RRS والتقاط تأكيد الكروموسوم لتحديد تحالف أجزاء حالة الكروماتين مع التعبير الجيني وبنية الكروماتين العالي.

بعد التجربة ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم التخلق السرطاني لاستكشاف أنماط حالة الكروماتين في عينات أورام المرضى. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية معالجة أنسجة الورم وفصلها ، وإجراء ترسيب مناعي للكروماتين ، وإعداد مكتبات لتسلسل الجيل التالي ، ومعالجة بيانات ما بعد التسلسل واكتساب رؤى حول الخطوات الأولية للتحليل النهائي. لا تنس أنه عند العمل مع الفورمالديهايد ، يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل غطاء الدخان المناسب ، عند تنفيذ هذا الإجراء.