Microinjection الأجنة وتقنية زرع "التلاعب الجينوم" فيتريبينيس ناسونيا

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء حقنة مجهرية بنجاح في أجنة الفيتية النازونياية من أجل تسهيل التلاعب الجيني. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة ببيولوجيا ناسونيا vitripennis ، مثل إنتاج السم وتحديد الجنس. الميزة الرئيسية لاستخدام هذه التقنية هي أنها تسمح بالتلاعب المباشر في جينوم الدبابير ، وتقدم مجموعة متنوعة من التعديلات الجينومية المتقدمة.

سيظهر الإجراء مينغ لي ، وهو ما بعد الدكتوراه من مختبرنا. للبدء ، قم بإعداد العديد من مستعمرات N.vitripennis عن طريق وضع 200 إلى 500 بالغ بنسبة ثلاثة إلى واحد من الإناث إلى الذكور في أقفاص السكن الحشرات. حافظ على الدبابير عند 25 درجة مئوية زائدة أو ناقص مع رطوبة نسبية 30٪ ودورة إضاءة / مظلمة من 12 إلى 12.

لمدة يومين ، اسمح للإناث المتزاوجة بالتغذي على شرانق S.bullata الطازجة ، بالإضافة إلى قطرات صغيرة من حجم واحد إلى عشرة لحجم محلول ماء السكروز. خلال اليومين التاليين ، قم بإزالة شرانق الذبابة لحرمان إناث الدبابير من موقع وضع البيض ، مما يجعلها شديدة الجاذبية. للحفاظ على مضيفات الشرانق S.bullota طازجة ، قم بتخزينها على حرارة 4 درجات مئوية فور الحصول عليها ، وقم بإزالتها فقط عند الحاجة.

فرق بين المضيفين الشباب الذين لديهم شرانق أحمر اللون ، والمضيفين الأكبر سنا الذين لديهم شرانق داكنة اللون. اسمح لإناث الدبابير بالتطفل في المضيف الصغير عن طريق وضع شرانق S.bullata الطازجة الفردية في سدادة رغوية مع ثقب بحجم الشرانق مقطوع في المنتصف. للحصول على أقصى تركيز للتطفل ، وتسهيل جمع الأجنة ، قم بكشف حوالي 0.2 سم فقط من الطرف الأمامي للمضيف ، والذي يتم تقريبه ، مقارنة بالطرف الخلفي ، وهو أكثر سمكا ، ويحتوي على فتحة تشبه الحفرة.

ضع الشرانق المضيفة في هذا الترتيب في القفص وانتظر حوالي 45 دقيقة للسماح للدبابير بالتطفل عليها. قم بإزالة العوائل المتطفلة عن طريق استعادتها يدويا والنقر برفق أو تفجير أي دبابير متبقية. استبدلها بمضيفين طازجين كل 15 دقيقة تقريبا لمواصلة جمع البيض في مرحلة مبكرة أثناء الحقن.

تحت مجهر تشريح ، استخدم الملقط لتقشير الطرف الخلفي من الشرانق الخارجي لمضيف متطفل حديثا بعناية لفضح بيض N.vitripennis. بعد ذلك ، قم بإعداد شريحة محاذاة الجنين باستخدام مادة لاصقة سائلة للصق زلة الغطاء على شريحة زجاجية نظيفة. باستخدام فرشاة رسم مبللة ذات رؤوس دقيقة ، قم بتنظيف الأجنة بعناية من المضيف ، مع التأكد من عدم إتلاف الجلد الناعم العذراء للمضيف.

بعد ذلك ، باستخدام فرشاة الرسم المبللة ، انقل ما يقرب من 20 جنينا واحدا تلو الآخر على الشريحة ، بجوار جانب زلة الغطاء مباشرة. قم بتوجيه الطرف الأمامي للجنين مقابل حافة شريحة الغطاء ، بحيث يتم توجيه الأطراف الخلفية للجنين في نفس الاتجاه. سيسمح ذلك بدقة أعلى للحقن في نفس الموضع بين جميع الأجنة.

بعد سحب إبر الحقن وفقا لبروتوكول النص ، قم بشطبة طرف الإبرة عن طريق لمس الطرف قليلا إلى صفيحة كاشطة ماسية عند 25 درجة مئوية لمدة 10 ثوان تقريبا. تحضير خليط الحقن المكون من كواشف تعديل الجينوم ، واحتفظ به على الجليد. استخدم طرف اللودر الدقيق لتحميل إبرة الحقن بميكرولتر من خليط الحقن.

بعد ذلك ، ضع الشريحة الزجاجية مع الأجنة المبطنة على مسرح المجهر المركب. أدخل الإبرة بعناية في الطرف الخلفي للجنين بزاوية رأسية من 25 إلى 35 درجة. بعد ذلك ، قم بحقن واحد إلى خمسة بيكوليتر من خليط الحقن وتأكد من أن الإمبيرو يتضخم قليلا مع الحقن.

في حالة حدوث انسداد ، حاول إعادة شطف الإبر. السيتوبلازم لأجنة N.vitripennis لزج ولزج بشكل غير عادي ، مما يؤدي إلى انسداد الإبرة بشكل متكرر. حقن ما يقرب من 20 إلى 40 بيضة في المرة الواحدة ، ثم توقف.

انقل البيض المحقون بفرشاة رسم مبللة عن طريق لمس البيض المحقون برفق وضعه في مضيف. ثم استمر في الحقن باستخدام مجموعة طازجة من البيض الموضوعة حديثا. من الناحية المثالية ، تكون هذه الخطوة أكثر فاعلية عندما يقوم شخص ما بجمع البويضات واصطفافها ، بينما يقوم شخص آخر بحقن مكونات تعديل الجينوم وزرع الأجنة المحقونة في الشرانق المضيفة.

بعد الحقن المجهري ، استخدم فرشاة رسم مبللة لوضع ما يصل إلى 40 جنينا محقون بعناية من G zero واحدا تلو الآخر على شرانق S.bullata التي تم لسعها سابقا. ضع الشرانق المضيفة في طبق بتري مع ورق ترشيح مبلل وكرات قطنية واحتضانها عند 25 درجة مئوية مع رطوبة 70٪ تقريبا حتى تفقس الأجنة المحقونة في غضون يوم إلى يومين. الأهم من ذلك ، يمكن ترك المضيفين مع شرانق مقشر ، وسوف يتطور بيض N.vitripennis بشكل طبيعي ، طالما يتم احتضانه في غرفة رطبة لمنع الجفاف.

بعد أن تفقس أجنة G صفر ، انقل الشرانق المضيفة إلى طبق بتري جديد واحتضانها عند 25 درجة مئوية و 70٪ رطوبة. راقب الشرانق المضيفة وحقن يرقات G zero يوميا. إذا كانت الشرانق المضيفة لها رائحة كريهة ، فقم بنقل اليرقات المحقونة إلى شرانق مضيفة صحية جديدة.

من أجل اختراق الإبرة الفعال والحقن المجهري في أجنة N.vitripennis ، تم اختبار مجذبات ماصات دقيقة مختلفة باستخدام عدة أنواع من الإبر الزجاجية الشعرية ذات الخيوط ، بما في ذلك الكوارتز ، سيليكات الألومنيوم ، والبورسليكات ، للحصول على طرف طويل مرغوب فيه يشبه نقص الجلد ، فعال في الحقن المجهري للأجنة N.vitripennis. كانت مكونات تعديل الجينوم المستخدمة هنا عبارة عن RNAs المختلطة وبروتين cas9 لتحرير الجينوم بوساطة أكثر وضوحا. في هذه التجربة ، تم حقن الحمض النووي الريبي sgRNA الذي يستهدف جين الزنجفر بكميات متفاوتة ، جنبا إلى جنب مع بروتين cas9 ، في N.vitripennis.

يوضح هذا الجدول أن معدلات البقاء على قيد الحياة كانت تعتمد على الجرعة ، حيث أدى زيادة تركيز sgRNA وبروتين cas9 إلى انخفاض معدلات البقاء على قيد الحياة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم الحرص على عدم ثقب أو تجفيف أجنة الدبابير أثناء التلاعب أو النقل باستخدام فرشاة رسم مبللة ذات رؤوس دقيقة أو معول جنين بعناية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استرداد أجنة الدبابير وحقنها الدقيق وزرعها بكفاءة من أجل إجراء تعديلات الجينوم المتقدمة بنجاح.