تنقية خلايا الكبد وخلايا بطانية جيبية من الكبد الماوس التروية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء نضح كبد الفأر الناجح لتسهيل تنقية مجموعات خلايا الكبد المحددة ذات الأهمية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أمراض الكبد حول كيفية المساعدة في وظائف مجموعات خلايا الكبد المحددة داخل فحوصات المختبر أو في الجسم الحي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي الكمية العالية من خلايا الكبد في الخلايا البطانية الجيبية التي يمكن الحصول عليها من كل كبد.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأنه من الضروري رؤية لون وشكل الكبد المهضوم على النحو الأمثل للحفاظ على صلاحية الخلية. لوضع قسطرة الوريد البابي ، استخدم أولا الجزء الخلفي من الملقط لتحريك الأمعاء إلى الجانب الأيمن من تجويف البطن للفأر ، وتعريض الوريد البابي ، واستخدم ملقطا منحنيا لتحريك قطعة 20 سم من خيوط خياطة البوليستر تحت الوريد البابي بين الكبد والوريد العلوي للبنكرياس والاثني عشر. استخدم الملقط لسحب الخيط بعناية إلى الجانب الآخر من ، بحيث يتمركز تحت الوريد البوابي.

واربط عقدة علوية فضفاضة حول الوريد البوابة. ضع الملقط المنحني تحت الوريد ، واسحب برفق جميع مواد الأنسجة نحو الذيل لتقويم الوريد. بعد ذلك ، ضع شطبة إبرة القسطرة متجهة لأعلى وبالتوازي مع الجزء السفلي من الوريد البابي بالقرب من الملقط ، وقم بثقب الوريد برفق بالإبرة.

عندما يكون الشطبة في تجويف الوريد ، اسحب الإبرة المحملة بنابض ، واستمر في دفع قسطرة راحة النخيل عبر الوريد ، حتى يصبح الشطبة بالقرب من منطقة الزهرة المتفرعة. بعد تثبيت العقدة حول القسطرة ، اضبط المضخة التمعجية على الفور على أربعة ملليمترات في الدقيقة وقم بتوصيل الطرف الذكري للأنبوب بالطرف الأنثوي للقسطرة ، وعند هذه النقطة يجب أن تبدأ في رؤية فرع الكبد. قطع الشريان الأورطي البطني للتصريف.

استخدم شريطا لاصقا لتثبيت الأنبوب على الوسادة السفلية. استخدم المقص لقطع جلد البطن عموديا ، للسماح بتصريف الدم والسائل التروية. ثم اضغط على الأوعية الدموية السائلة عدة مرات باستخدام الملقط المستقيم لتضخيم الكبد ، والتأكد من تصريف كل الدم ، وزرع الكبد ب PBS حتى تتجمع أنسجة الكبد.

لحصاد خلايا الكبد ، قم أولا بتغيير أنبوب التدفق الخارجي من قارورة سعة لتر واحد من PBS إلى قارورة سعة 125 مليلتر ، تحتوي على مخزن مؤقت اثنين ، مكمل بالكولاجيناز -4. عندما يصل الكولاجيناز إلى الكبد ، اضغط لفترة وجيزة ولكن بإحكام على الأوعية الدموية السائلة لزيادة الضغط والسماح للمخزن المؤقت للهضم بملء جميع فصوص الكبد. حرر الوعاء الدموي قبل أن ينفجر المخزن المؤقت عبر النسيج الضام المحيط بالكبد.

واسمح للمخزن المؤقت بالانتشار عبر الكبد حتى يتدفق الحجم بالكامل عبر الأنسجة. بعد ذلك ، ضع طبقا متبلورا يحتوي على 10 مل من المخزن المؤقت بجوار الماوس ، واستخدم ملقطا مستقيما ومقصا لنقل الكبد إلى الطبق. انقل الطبق إلى غطاء مزرعة الأنسجة المعقم ، وباستخدام تقنية معقمة ، أمسك الكبد لتقشير الكبسولة.

هز الخلايا برفق من أنسجة الكبد ، واسكب محلول الخلية الناتج من خلال مرشح 100 ميكرون في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. ثم اشطف بقايا الكبد من الفلتر بمزيد من الفلتر. عندما يبدو الكبد خاليا من الخلايا ، قم بتصفية المرشح المسحوب من خلال مرشح 40 ميكرون في أنبوب ثان سعة 50 مليلتر وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

اسكب الخلية غير المتني والخلايا الكبدية الميتة التي تحتوي على مادة طافية في أنبوب جديد سعة 50 مليلتر على الجليد بحركة واحدة ، للحفاظ على الحبيبات وإعادة تعليق الحبيبات في 40 مل من العازلة الطازجة للطرد المركزي التالي. لعزل الخلايا البطانية الجيبية ، قم بالطرد المركزي للطافية التي تحتوي على خلايا غير متني. اسحب معلقات الخلية إلى أنبوب مخروطي واحد جديد سعة 50 مليلتر ، وارفع الحجم الإجمالي إلى 35 ملليلترا.

اجمع الخلايا المسحوبة عن طريق الطرد المركزي ، واستخدم ماصة سعة 25 مليلتر لنقل أعلى 25 مل من الخلية غير المتني التي تحتوي على مادة طافية بعناية إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مليلتر على الجليد. أضف 25 مل من الوسط الطازج إلى الأنبوب ، وأعد تعليق الحبيبات لإجراء طرد مركزي ثان وإزالة المواد الطافية ثم قم بالطرد المركزي للطافية وأضف 15 مل من محلول بيركول بنسبة 50٪ إلى أنبوب جديد سعة 50 ملليلترا.

باستخدام ماصة مضبوطة على أقل سرعة طرد ، قم بتراكب 20 مل من 25٪ Percoll على محلول Percoll بنسبة 50٪ ، وأعد تعليق الخلايا غير المتني في 10 ملليلتر من وسط أربع درجات مئوية. ضع طبقة من الخلايا بعناية على محلول Percoll. وفصل الخلايا عن طريق الطرد المركزي المتدرج الكثافة.

بعد ذلك ، قم بشفط أول 30 مل من المحلول ، واستخدم ماصة نقل بلاستيكية سعة خمسة ملليلتر لتجميع الخلايا البطانية الجيبية وخلايا Kupffer الموجودة في الطور البيني لمحلول التدرج بكثافة 25 إلى 50٪ في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 ملليلترا. اغسل الخلايا ب 50 مل من الوسط وأعد تعليق الحبيبات أثناء شطف جوانب قاع الأنبوب في 12 مل من الوسط الدافئ. لفصل الخلايا البطانية الجيبية عن خلايا Kupffer ، انقل معلق الخلية إلى طبق بتري من البوليسترين في حاضنة زراعة الأنسجة المرطبة لمدة ثماني دقائق.

في نهاية الحضانة، استخدم ماصة سعة 25 مل لشفط المادة الطافية واستخدم المادة الطافية لشطف الطبق باستخدام الماصة المضبوطة بأقل سرعة لتجميع الخلايا البطانية الجيبية المتبقية. ثم انقل الخلايا البطانية الجيبية إلى أنبوب جديد سعة 50 ملليلترا. ثم اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي لإعادة تعليقها والطلاء في أطباق زراعة الخلايا المطلية بالكولاجين.

يكشف مسح المجهر الإلكتروني لكبد الفأر بعد التروية المثبتة PBS بطريقة مشابهة لما هو موضح للتو ، عن رؤية واضحة للتشريح الدقيق للكبد والزغابات الدقيقة بين خلايا الكبد. تظهر خلايا الكبد التي يتم حصادها أثناء الدورات منخفضة السرعة في وقت مبكر من الإجراء نقاء عاليا بعد أربع غسلات في ألبومين مصل البقر الذي يحتوي على مخازن مؤقتة. ينتج عن فصل الخلايا البطانية الجيبية عن طريق الالتصاق الانتقائي على طبق بتري من البوليسترين المطلي بالكولاجين نقاء يتراوح من 83 إلى 90٪ يعتمد إلى حد كبير على الفعالية الإجمالية لهضم الكولاجيناز.

تكشف القياسات الكمية باستخدام الفحص المجهري الضوئي من إجراء فصل تمثيلي ، كما هو موضح للتو ، عن نتائج العزل النموذجية لمجموعة خلايا الكبد النقية بنسبة 100٪ تقريبا. وما يزيد قليلا عن 89٪ من الخلايا البطانية الجيبية النقية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قسطرة الوريد البابي للفأر وكيفية تنقية كل من خلايا الكبد والخلايا البطانية الجيبية من كبد الفأر.

يمكن أيضا استخدام هذا الإجراء لتنقية الخلايا الساتلية من الجزء غير المتني بعد عزل خلايا الكبد باستخدام تدرجات كثافة مختلفة وسرعات طرد مركزي.