هندسة Fluorescence 'الذهبي' بإدراج الضغط الانتقائي من الأحماض الأمينية غير المقبول وتحليل البروتين الكتلي والأسفار

الهدف من هذه التجربة هو استبدال حمض أميني أساسي بحمض أميني غير قانوني لإنتاج البروتين المؤتلف عن طريق دمج الضغط الانتقائي لإنتاج بروتين فلورسنت الذهب الجديد. تهدف طريقة دمج الضغط الانتقائي إلى إنتاج بروتينات ذات ميزات كيميائية جديدة. هذا مفيد بشكل خاص عند محاولة فهم أو هندسة وظيفة البروتين.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها سهلة نسبيا في إجراؤها لأنها تشبه إنتاج البروتين المؤتلف الشائع. يعد التألق المرتبط بالوقت والطول الموجي مفيدا في التحقيق في ديناميكيات الحالة المثارة للبروتين المعدل ، مما يجعل من السهل فهم تأثير الحمض الأميني غير المتعارف عليه الذي يتم إدخاله في الكروموفور على الخصائص البصرية. يمكن تطبيق SPI ، من حيث المبدأ ، على أي إعداد لإنتاج البروتين تتوفر فيه سلالات غذائية ووسائط محددة كيميائيا.

وهذا يشمل السلالات البكتيرية الأخرى وكذلك زراعة خلايا الثدييات. يعد توقيت وإعداد شروط التعبير أمرا بالغ الأهمية لأنه من الضروري قمع إنتاج البروتين من النوع البري غير المعدل. لهذا السبب يجب تحسين بعض المعلمات مثل درجة الحرارة أو وقت الحث أو تكوين وسط الزراعة.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة بعد الدراسات الأولية لمستخلص البروتين مع الأحماض الأمينية المحتوية على الميثيل مثل السيلينوميثيونين. سيوضح الإجراء ألموت بيلزر ، طالب من مختبري. لبدء هذا الإجراء ، قم بتحويل خلايا الإشريكية القولونية التربتوفان مع تعبير البلازميد ل ECFP.

استخدم مستعمرة واحدة لتلقيح استزراع مسبق من خمسة ملليلتر متوسط رطل مكمل بأمبيسلين في أنبوب الاستزراع. احتضن بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة. في اليوم التالي ، قم بتلقيح 100 مل من وسط NMM19 المكمل باستخدام مليلتر واحد من الثقافة الليلية في قارورة Erlenmeyer سعة لتر واحد.

بعد ذلك ، احتضن الثقافة طوال الليل في شاكر مداري عند 200 دورة في الدقيقة و 30 درجة مئوية. في اليوم التالي ، قم بقياس الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر كل 30 دقيقة حتى تتغير القيمة بأقل من 0.05 خلال 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للثقافة عند 5 ، 000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق لحصاد الخلايا البكتيرية.

تخلص من المادة الطافية عن طريق الصب. أعد تعليق الخلايا في وسط NMM19 المكمل بالأمبيسلين إلى حجم إجمالي قدره 100 ملليلتر. انقل هذا التعليق مرة أخرى إلى نفس قارورة Erlenmeyer.

أضف 4-أمينو إندول إلى التركيز النهائي البالغ مللي مول. احتضن في شاكر مداري لمدة 30 دقيقة عند 30 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة. بعد 30 دقيقة ، أضف IPTG إلى المزرعة إلى تركيز نهائي يبلغ 0.5 مللي مولار للحث على التعبير الجيني المستهدف.

احتضن طوال الليل في شاكر مداري عند 30 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة. في اليوم التالي ، قم بحصاد الخلايا البكتيرية عن طريق الطرد المركزي عند 5000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية عن طريق الصب.

قم بتجميد حبيبات الخلية عند 20 درجة مئوية تحت الصفر أو 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تصبح جاهزة لإجراء تنقية البروتين المستهدف. أولا ، قم بإعداد تحلل الخلية البكتيرية كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد تحضير عمود الكروماتوغرافيا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، استخدم المخزن المؤقت الملزم لموازنة عمود كروماتوغرافيا تقارب أيون المعدن الثابت.

قم بتحميل المحللة على العمود حتى الانتهاء. لاحظ البروتين ذو اللون الذهبي المرتبط براتنج الكروماتوغرافيا. اغسل العمود بمخزن مؤقت ملزم.

ثم قم بإزالة البروتين المستهدف باستخدام المخزن المؤقت للشطف. اجمع وجمع أي كسور مملوثة تحتوي على بروتين فلورسنت الذهب ، والتي يمكن التعرف عليها من خلال اللون الذهبي المرئي. بعد ذلك ، قم بإعداد غشاء غسيل الكلى بقطع الوزن الجزيئي بين 5 ، 000 و 10 ، 000 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

عينة سعة مليلتر واحد مقابل 100 مل على الأقل من المخزن المؤقت لمدة ساعتين على الأقل. للبدء ، استخدم المخزن المؤقت لمرض التصلب العصبي المتعدد لتخفيف عينة البروتين إلى 0.1 ملليغرام لكل مليلتر ، بحيث يكون الحجم النهائي 80 ميكرولترا. الماصة بعناية للخلط.

انقل المحلول إلى قارورة أخذ العينات الأوتوماتيكية MS مع إدراج زجاجي ، وأغلقه بغطاء. انقر فوق القارورة لإزالة فقاعات الهواء. بعد ذلك ، قم بإعداد فراغ يحتوي على مخزن مؤقت MS في قارورة ثانية.

ضع كلا القارورتين في جهاز أخذ العينات الآلي HPLC. بعد ذلك ، قم بإعداد ومعايرة أداة MS وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. اضبط حجم حقن جهاز أخذ العينات الأوتوماتيكي على خمسة ميكرولترات للكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء إلى جانب طريقة قياس الطيف الكتلي للتأين بالرش الكهربائي

قم بإنشاء قائمة عمل للتشغيل الفارغ، متبوعا بتشغيل نموذج GdFP. قم بتعيين حجم الحقن ، ومواضع قارورة أخذ العينات التلقائية المقابلة ، وقم بتشغيل قائمة العمل. للبدء ، قم بإعداد محلول بروتين فلورسنت ذهبي وكاشف لعد الفوتون الفردي المرتبط بالوقت والطول الموجي كما هو موضح في بروتوكول النص.

باستخدام برنامج عد الفوتون الفردي ، احصل على انبعاث مضان بمعدل عد يبلغ حوالي 200،000 فوتون في الثانية حتى يتم تجميع ما يقرب من 10،000 عدد في الحد الأقصى لاكتساب منحنيات اضمحلال الفلورة. بعد ذلك ، استبدل كوفيت العينة بكفيت كوارتز بحجم سنتيمتر واحد مملوءة بالسيليكا الغروية في المخزن المؤقت PBS. أخرج مرشح الليزر ، واضبط الشبكة للحصول على فوتونات 470 نانومتر في القناة المركزية للكاشف.

بعد ذلك ، احصل على وظيفة الاستجابة الآلية حتى يتم تجميع ما يقرب من 10 ، 000 عدد في الحد الأقصى للانبعاث. قم بتحويل البيانات الناتجة وملاءمتها ورسمها كما هو موضح في بروتوكول النص للحصول على الأطياف المرتبطة بالاضمحلال ، والتي تمثل اعتماد أوقات اضمحلال التألق على الطول الموجي للانبعاث. في هذه الدراسة ، يتم استخدام قياس الطيف الكتلي لتأكيد أن متغير الفلوروفور من نوع البروتين الفلوري الأخضر ذو الإزاحة الحمراء الطيفية ، والذي يسمى بروتين فلورسنت الذهب ، قد تم إنتاجه بنجاح.

في حين أن ECFP من النوع البري يحتوي على كتلة بروتين محسوبة تبلغ 28،283.9 دالتون بعد نضج الكروموفور ، فإن الكتلة المقابلة لبروتين فلورسنت الذهب هي 28،313.9 دالتون. يظهر طيف ESI-MS غير المعقد لبروتين فلورسنت الذهب ذروة كتلة رئيسية عند حوالي 28،314.1 دالتون ، منحرفا عن القيمة النظرية بأقل من 10 أجزاء في المليون. هذا يؤكد دمج الأحماض الأمينية غير الكنسية عن طريق دمج الضغط الانتقائي.

يحتوي طيف امتصاص ECFP على اثنين من القصوى المميزة عند 434 نانومتر و 452 نانومتر. في المقابل ، يتميز بروتين الفلورسنت الذهبي بشريط امتصاص أحمر عريض بحد أقصى يبلغ 466 نانومتر. في حين أن الحد الأقصى لامتصاص EGFP قد تحول إلى اللون الأحمر إلى 488 نانومتر ، فإن طيف انبعاث التألق لبروتين الفلورسنت الذهبي وتحول Stokes المقابل ل GdFP يشير إلى أنه الأكثر تحولا للأحمر من بين جميع مشتقات بروتين الفلورسنت الأخضر Aequorea victoria.

هنا انبعاث التألق الذي تم حله بمرور الوقت والذي يتم مراقبته بواسطة عد الفوتون الفردي. تظهر منحنيات الاضمحلال تحلل مضان أسرع قليلا عند 600 نانومتر مقارنة ب 550 نانومتر. يعتمد انبعاث مضان بروتين فلورسنت الذهب بشدة على درجة الحموضة ، كما هو معتاد للعديد من متغيرات البروتين الفلوري الأخضر.

كما هو موضح هنا ، هناك انخفاض واضح في التألق عند درجة الحموضة المنخفضة ، على الرغم من أن الخصائص الطيفية تظل ثابتة. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في ثلاثة أيام عند البدء من مستعمرات من الخلايا البكتيرية المحولة أو من مخزونات الجلسرين المجمدة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم التأكد من استنفاد الحمض الأميني المستهدف.

يجب أن تمتص الخلية ncAA ، ومتوافقة حيويا ، ودمجها في البروتينات بواسطة السلالة المختارة للتغذية. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إنشاء مجموعة كبيرة ومتنوعة من البروتينات للأغراض الهندسية. اعتمادا على طرق البروتين المستهدفة ، مثل أجهزة تحليل استقرار البروتين ، أو فحوصات النشاط الأنزيمي ، أو التحليل الطيفي الفلوري ، أو تبلور البروتين ، يمكن استخدامها لوصف تأثير الأحماض الأمينية غير الكنسية على الخصائص الوظيفية والهيكلية.

بعد تطويرها ، أثبتت هذه التقنية أنها مفيدة جدا في مجال البيولوجيا التركيبية ، حيث زودتها ببروتينات وبروتينات جديدة للطبيعة. هذا يوسع القدرات الكيميائية لهندسة البروتين. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية دمج الأحماض الأمينية غير الكنسية في البروتينات المؤتلفة عن طريق دمج الضغط الانتقائي ، وكيفية التحقق من إدخال حمض أميني اصطناعي عن طريق قياس الطيف الكتلي ، وكيفية تحليل البروتين الفلوري عن طريق التألق الذي تم حله بمرور الوقت.