تصور أكتين وسيتوسكيليتونس ميكروتوبولي في المشبك محصنة خلية ب استخدام الفحص المجهري استنفاد (STED) حفز الانبعاثات

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تلطيخ الهياكل الخلوية للأكتين والأنابيب الدقيقة في المشبك المناعي للخلايا البائية من أجل استنفاد الانبعاث المحفز ، أو الفحص المجهري STED ، وتصوير هيكلها ، وتنظيمها في العلاقات المكانية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول تنظيم الهيكل الخلوي أثناء تنشيط الخلايا البائية ، بما في ذلك إعادة تنظيم الهياكل الخلوية للأكتين والأنابيب الدقيقة أثناء تكوين المشبك المناعي. تتمثل الميزة الرئيسية للفحص المجهري متعدد الألوان STED في أنه يسمح بالتصوير المتزامن للهيكل الخلوي للأكتين ، وشبكة الأنابيب الدقيقة ، والبروتينات الرئيسية المرتبطة بالهيكل الخلوي بدقة مقياس نانومتر.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة حول تنشيط الخلايا البائية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على تكوين المشبك المناعي لأنواع الخلايا المناعية الأخرى مثل الخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا التائية. بشكل عام ، سيجد الأفراد الجدد في هذه الطريقة أن تحسين إعدادات المجهر للتصوير المتزامن والفلوروفورات المتعددة باستخدام STED سيتطلب بعض الممارسة. ستظهر هذا الإجراء جنبا إلى جنب مع جيا وماديسون كيت تشوي وكيتلين بريتشارد.

ابدأ بالطرد المركزي 2.5 مرة 10 إلى 6 ، خلايا سرطان الغدد الليمفاوية A20 B لكل تعداء ، وإعادة تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من كاشف التعدي المكمل بواحد إلى 2.5 ميكروغرام من الحمض النووي للبلازما ذي الأهمية. امزج المحاليل برفق وانقل كل جزء من الخلايا إلى آبار فردية من صفيحة من ستة آبار. اضبط الحجم في كل بئر على ملليلترين بوسط كامل 37 درجة مئوية وضع الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة.

في صباح اليوم التالي ، اغمس 1.5 غطاء زجاجي دائري مقاس 18 ملم في 100٪ من الميثانول واترك الغطاء يجف تماما لمدة 10 دقائق تقريبا. ضع الغطاء المجفف في آبار فردية من لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 12 بئرا وأضف 400 ميكرولتر من الجسم المضاد للجلوبولين المناعي G المضاد للماعز في وسط كل غطاء بحيث تتشكل فقاعة في المنتصف وتنتشر إلى الحواف دون أن تقطر في البئر. احتضن الأغطية في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

ثم اشطف الأغطية بملليلتر واحد من PBS المعقم لكل بئر ، ثلاث مرات ، لإزالة أي أجسام مضادة غير مرتبطة. بعد الغسيل الأخير ، قم بتخزين كل غطاء في مليلتر واحد من PBS الطازج والمعقم حتى بذر الخلايا. عندما تكون الخلايا المنقولة جاهزة ، اجمعها في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الكريات في مليلتر واحد من محلول ملحي معزاز HEPES المعدل المكمل ب FBS.

بعد العد ، قم بتخفيف الخلايا إلى اثنين في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل تركيز مليلتر ومحلول ملحي مخزن مؤقت HEPES المعدل بالإضافة إلى FBS ، واستخدم الملقط لنقل كل غطاء إلى قطعة من فيلم البارافين. أضف 250 ميكرولترا من الخلايا إلى كل غطاء واحتضن الغطاء عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في الظلام للسماح للخلايا بالانتشار عبر الأسطح المطلية بالغلوبولين المناعي G. في نهاية الحضانة ، قم بإزالة المحلول الملحي الزائد من كل شريحة وقم بتغطية كل غطاء ب 350 ميكرولتر من المثبت ، مع الحرص على تغطية السطح بالكامل.

بعد 10 دقائق في الظلام في درجة حرارة الغرفة ، استخدم ماصة دقيقة لشفط المثبت بعناية من حافة كل غطاء وغسل الغطاء بسعة 500 ميكرولتر من النفاذية والمخزن المؤقت للحجب . بعد ذلك ، قم باختراق الخلايا وسدها ب 250 ميكرولتر من النفاذية الطازجة ومنع المخزن المؤقت لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بعد ذلك ، قم بإزالة المخزن المؤقت الزائد وقم بتسمية الخلايا ب 50 ميكرولترا من الجسم المضاد الأساسي المعني لمدة 30 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.

في نهاية الحضانة ، اغسل الغطاء ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ لكل غسلة وأضف 50 ميكرولترا من الجسم المضاد الثانوي المناسب لكل غطاء لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل الجسم المضاد الثانوي ، أضف 10 ميكرولترات من كاشف التثبيت إلى شريحة المجهر وقم بتركيب الغطاء على شرائح مجهر فردية ، بحيث يكون جانب الخلية لأسفل. ثم اترك الشرائح تجف طوال الليل في الظلام للتصوير في اليوم التالي.

لتصوير الخلايا باستخدام الفحص المجهري STED ، قم أولا بتشغيل مجهر STED. قم بتنشيط الليزر في مصباح الإضاءة اللفائي فلوري وافتح برنامج المجهر. اضبط معلمات ليزر استنفاد STED وقم بتحميل العينة الأولى على المجهر.

باستخدام العدسة، ركز يدويا على العينة لتحديد خلية ذات تعبير GFP معتدل. قم بتكبير الخلية المحددة وحدد منطقة الاهتمام المراد تصويرها. اضبط التركيز البؤري بحيث يكون مستوى XY للخلية الأقرب إلى الغطاء في نطاق التركيز البؤري.

بعد ذلك ، ضمن علامة التبويب Acquisition في البرنامج ، حدد خيار Between Frames في لوحة المسح المتسلسل لتعيين الحصول على الصورة على الحصول على الإطار المتسلسل. اضبط طاقة الليزر STED لكل فلوروفور واستخدم شريط الانزلاق لضبط قوى الليزر وفقا للفلوروفورات المستخدمة في التجربة. لزيادة الدقة وتقليل إشارة الخلفية، افتح إعدادات الاكتساب واستخدم القائمة المنسدلة لتحديد قيمة أكبر من قيمة واحدة لزيادة متوسط الخط و/أو الإطار.

تحقق من خيار الكسب لكل فلوروفور والقيم المحددة لاكتساب الوقت للحصول على إشارة الفلورسنت المناسبة للاتصال الجنسي بنظام الاتصال الجنسي المسور بالوقت وزيادة طاقة ليزر STED لتحسين الدقة. من الأهمية بمكان تحسين وقت الاستحواذ على عينة المجهر والفلوروفورات المستخدمة لتحسين الدقة دون فقدان الكثير من إشارة الفلورسنت. ثم احصل يدويا على صور متعددة لضمان قابلية التكرار وفك الالتفاف باستخدام حزمة برامج فك الالتفاف وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

بالنسبة لخلايا سرطان الغدد الليمفاوية A20 B ، تنتشر على الأجسام المضادة للجلوبولين المناعي NT الثابتة. يوفر الفحص المجهري STED المستخدم جنبا إلى جنب مع برنامج إزالة الالتواء صورا عالية الدقة لهياكل الهيكل الخلوي مقارنة بالفحص المجهري متحد البؤر وحده. على الرغم من أن فك الالتفاف للصور متحد البؤر يؤدي إلى تحسن كبير في دقة الصورة ، إلا أن صور STED غير المعقدة توفر معلومات هيكلية أكثر تفصيلا من الصور البؤرية المعقدة.

يمكن أيضا استخدام STED أحادي اللون للحصول على صور ثلاثية الأبعاد فائقة الدقة لشبكة الهيكل الخلوي للخلايا البائية بأكملها. في هذه الصور متعددة الألوان STED ، يمكن ملاحظة تلطيخ الحلقة المحيطية للأكتين الشجيري بالتزامن مع تلطيخ الأنابيب الدقيقة. عند استخدام الخلايا المنقولة ببروتينات اندماج الفلورسنت ، فإن تحقيق مستويات التعبير المثلى وتجنب القطع الأثرية بسبب الإفراط في التعبير هي اعتبارات مهمة ، في حين أن التعبير المنخفض جدا عن بروتين الاندماج الفلوري يؤدي أيضا إلى صور ذات جودة رديئة.

الدقيق ، ليشمل منطقة الاهتمام بأكملها ، ضروري أيضا. على سبيل المثال ، في هذه الصورة ، كانت أجزاء فقط من شبكة الأنابيب الدقيقة داخل المستوى البؤري الأقرب إلى الغطاء ، مما يمنع التحليل الكامل للعينة. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون يومين.

يوم واحد لإعداد العينة وتلطيخها ويوم واحد للتصوير المنقولة جنسيا. من المهم أن تتذكر معايرة كمية البلازما التي يجب استخدامها لنقل الخلايا حتى تحصل على تعبير كاف عن البروتين الفلوري للكشف أثناء التصوير مع تجنب القطع الأثرية من الإفراط في التعبير. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تحفيز التعبير عن بروتينات اندماج الفلورسنت المختلفة لتسهيل توطين البروتينات الأخرى التي تنظم ديناميكيات الهيكل الخلوي وتنظيمه ، أو لتصور التوزيع الخلوي الفرعي للبروتينات المشاركة في العمليات الخلوية الأخرى.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام الفحص المجهري STED لتصوير هياكل الهيكل الخلوي والبروتينات التي تشارك في تكوين المشبك المناعي. لا تنس أن العمل مع المثبتات مثل الجلوتارالديهايد يمكن أن يكون خطيرا للغاية وأن الاحتياطات مثل العمل في غطاء الدخان الكيميائي يجب دائما اتخاذ الاحتياطات عند استخدام هذه الأنواع من الكواشف.