التحقيق في توليف الحمض النووي الريبي استخدام الوسم 5-بروموريديني وإيمونوبريسيبيتيشن

الهدف العام من هذه التجربة هو قياس التغيرات في تخليق الحمض النووي الريبي عن طريق وضع العلامات على البروموريدين والترسيب المناعي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال استقلاب الحمض النووي الريبي عن طريق قياس ما إذا كان التغيير في مستويات الحمض النووي الريبي ناتجا عن تغيرات في تخليق الحمض النووي الريبي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن استخدامها في أي نوع مفضل من زراعة الخلايا ويمكن الوصول بسهولة إلى المواد المستخدمة.

لبدء البروتوكول ، قم بالبذور 3.5 مرات 10 إلى الخلايا HEK293T السادسة في طبق بتري طوله 10 سم في 10 ملليلتر من وسائط النمو للحصول على إجمالي أكبر من 40 ميكروغراما من الحمض النووي الريبي عند الاستخراج بعد 48 ساعة. حافظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون 2.48 ساعة بعد البذر ، واستنشق ثمانية ملليلتر من وسط النمو ، واترك ملليلترين لمنع الخلايا من الجفاف. أضف ملليمول من البروموريدين والعلاج إلى وسط النمو ، وقم بإزالة المليلترين المتبقيين من الخلايا قبل إعادة تطبيق ثمانية ملليلتر من البروموريدين المحتوي على وسائط النمو.

بعد ذلك ، احتضان الخلايا لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا في خمسة ملليلتر من عازلة هانك ، وقم بتربسين الخلايا بملليلترين من 0.05٪ تريبسين لمدة خمس دقائق. أضف ثمانية ملليلتر من وسائط النمو لإيقاف التفاعل ، وانقل الخلايا إلى أنبوب سعة 15 مليلتر ، وقم بتدوير الخلايا لمدة دقيقتين عند 1000 مرة جرام.

بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية واستخرج الحمض النووي الريبي الكلي من حبيبات الخلية باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي الريبي ، وقم بتصفية الحمض النووي الريبي في الماء الخالي من RNase. هذه التقنية حساسة للغاية ، وبالتالي من المهم العمل مع الحمض النووي الريبي بجودة عالية. لذلك يعد استخراج الحمض النووي الريبي خطوة حاسمة ، ولكن يمكن أيضا إجراؤها بسهولة باستخدام مجموعات استخراج الحمض النووي الريبي اليوم.

قم بإعداد الخرز في دفعة واحدة لعدد العينات المراد فحصها بالإضافة إلى واحدة إضافية لحساب الفقد أثناء سحب العينات والخلط الدوامي. قم بتعليق الخرز المغناطيسي IgG المضاد للفأر جيدا عن طريق الخلط الدواري ، وأخرج 20 ميكرولترا من الخرز لكل عينة في أنبوب 1.5 مليلتر خال من RNase. ضع الأنبوب سعة 1.5 ملليلتر في حامل مغناطيسي لمدة 20 ثانية حتى تتجمع الخرزات على الجانب.

قم بإزالة المادة الطافية ، وأخرج الأنبوب من الحامل المغناطيسي ، وأعد تعليق الخرزات في 40 ميكرولترا من المخزن المؤقت البروموريدين-IP مرة واحدة عن طريق سحب العينات. قم بتدوير الأنبوب لمدة ثانيتين في جهاز طرد مركزي منضدي ، ثم ضعه مرة أخرى في الحامل المغناطيسي ، وقم بإزالة المادة الطافية. بعد ذلك ، قم بحظر الارتباط غير المحدد للخرز باستخدام الهيبارين.

أعد تعليق الخرزات في مليلتر واحد من مرة واحدة من بروموريدين-IP بالإضافة إلى ملليغرام واحد لكل مليلتر من المخزن المؤقت للهيبارين ، وقم بتدوير الأنبوب لمدة 30 دقيقة. ثم اغسل الخرز مرة واحدة. أعد تعليق الخرزات في مليلتر واحد من المخزن المؤقت بروموريدين-IP مرة واحدة ، وأضف 1.25 ميكروغرام لكل عينة من الجسم المضاد المضاد لألفا برومودوكسيوريدين.

احتضان الخرزات لمدة ساعة واحدة أثناء الدوران. بعد الحضانة ، اغسل الخرز ثلاث مرات. أعد تعليق الخرزات المغسولة في 50 ميكرولتر لكل عينة من المخزن المؤقت بروموريدين-IP مرة واحدة مكملا ببروموريدين واحد ، واترك الخرزات تدور لمدة 30 دقيقة.

بعد الدوران ، اغسل الخرزات ثلاث مرات ، وأعد تعليق الخرزات في 50 ميكرولترا لكل عينة من المخزن المؤقت bromouridine-IP مرة واحدة. قم بقياس تركيزات الحمض النووي الريبي في مستخلصات الحمض النووي الريبي باستخدام القياس الطيفي الضوئي المرئي بالأشعة فوق البنفسجية ، وقم بتخفيف 40 ميكروغراما من الحمض النووي الريبي من كل عينة في ماء خال من RNase إلى حجم إجمالي يبلغ 200 ميكرولتر. بعد تغيير طبيعة الحمض النووي الريبي لمدة دقيقتين عند 80 درجة مئوية ، قم بتدوير العينات لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي على الطاولة.

بعد الغزل ، أضف 200 ميكرولتر من مرتين بروموريدين IP بالإضافة إلى BSA ، مثبط RNase. بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من الخرزات المعلقة والمحضرة إلى كل عينة ، وقم بتدوير العينات لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة ، اغسل الخرز أربع مرات.

أعد تعليق الخرزات في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف لتصفية الحمض النووي الريبي ، وأضف بسرعة 200 ميكرولتر من درجة الحموضة 6.6 الفينول لإزالة أي جزيئات غير حمض نوال الريبي من العينة. قم بتدوير العينة للخلط ، وقم بتدويرها لمدة ثلاث دقائق عند 25 ، 000 مرة جم في جهاز طرد مركزي على الطاولة. بعد ذلك ، استنشق أكبر قدر ممكن من المرحلة العليا ، حوالي 190 ميكرولتر ، وانقله إلى أنبوب يحتوي على 200 ميكرولتر من درجة الحموضة 6.6 فينول كلوروفورم.

تأكد من شفط نفس الكمية عبر العينات. قم بتدوير العينة وقم بتدويرها. بعد الدوران ، قم بإجراء استخراج الكلوروفورم عن طريق شفط المرحلة العليا المائية ، حوالي 180 ميكرولتر ، ونقله إلى أنبوب يحتوي على 200 ميكرولتر من الكلوروفورم.

قم بالتدوير ثم تدوير العينة. استنشاق المرحلة العليا المائية ، حوالي 170 ميكرولتر ، ونقلها إلى أنبوب يحتوي على 17 ميكرولتر من ثلاثة أسيتات الصوديوم ذات درجة الحموضة المولية لتحييد وترسيب الحمض النووي الريبي من المحلول المائي. بعد ذلك ، أضف ميكرولترين من الجليكوجين ، والذي سوف يترسب مع الحمض النووي الريبي ويجعل الحبيبات أكثر وضوحا.

أضف 500 ميكرولتر من 96٪ من الإيثانول لزيادة الارتباط بين أيونات الملح والحمض النووي الريبي ، واخلطها عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات. اترك الأنبوب طوال الليل عند 20 درجة مئوية تحت الصفر أو لمدة 15 دقيقة على الثلج الجاف. قم بتدوير العينة المبردة ، وتخلص من المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات ، واغسل الحبيبات في 185 ميكرولتر من 75٪ إيثانول لإزالة أي ملح متبقي.

بعد ذلك ، قم بتدوير العينة عند 25 ، 000 مرة جم عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تخلص من المادة الطافية تماما دون إزعاج الحبيبات ، واترك الحبيبات حتى تجف لمدة خمس إلى 10 دقائق مع فتح الغطاء. أعد تعليق الحبيبات في 10 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase المطبق على جانب الأنبوب لتجنب إزعاج الحبيبات.

تمت معالجة خلايا AsPC-1 بالبروموريدين لمدة صفر وساعة واحدة وساعتين و 4.5 ساعة ، تليها استخراج الحمض النووي الريبي الكلي والبروموريدين-IP. تم قياس GAS5 و GAPDH في الحمض النووي الريبي بروموريدين-IP ، مما أظهر أن ساعة واحدة من وضع العلامات كانت كافية للوصول إلى تغيير تسعة و 44 ضعفا مقارنة بالخلفية. لم يحفز ملليمول من العلاج بالبروموريدين أي تغييرات مورفولوجية في الخلايا HEK293T لمدة ساعة واحدة أو علاج أطول لمدة أربع ساعات.

تسبب تثبيط PLK-2 في زيادة في mRNA ألفا سينوكلين في كل من المدخلات و bromouridine-IP ، مما يشير إلى أن الزيادة في الحمض النووي الريبي في الحالة المستقرة ناتجة عن زيادة تخليق الحمض النووي الريبي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تسمية الحمض النووي الريبي المركب حديثا بالبروموريدين وإجراء ترسيب مناعي لاحق للبروموريدين والحمض النووي الريبي المسمى.