إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) من "التعديلات هستون" من Saccharomyces cerevisiae

الهدف العام من بروتوكول الترسيب المناعي للكروماتين هو تحديد وفرة وتوطين تعديلات الهيستون في مناطق محددة في جميع أنحاء جينوم الخميرة الناشئة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في تنظيم الكروماتين ، مثل كيفية ارتباط تعديلات الهيستون بالتحكم في التعبير الجيني وكيف تتغير هذه التعديلات استجابة للظروف البيئية المختلفة. بروتوكول متعدد الاستخدامات للغاية يمكن استخدامه للتحقيق في العديد من تعديلات الهيستون المختلفة وسلالات E المتعددة في وقت واحد.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتعديلات الهيستون ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على التحقيق في بروتينات رابطة الكروماتين الأخرى من خلال استخدام علامات الحاتمة أو الأجسام المضادة المتاحة. ابدأ هذا الإجراء عن طريق زراعة خلايا الخميرة ، وتلقيح 10 مل من وسط YPD بمستعمرة واحدة من كل سلالة مناسبة ، وزراعتها 30 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها. في اليوم التالي بعد قياس الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر أو OD600 من المزرعة ، قم بتخفيف المزرعة إلى OD600 من 0.2 في 100 مل من YPD في قارورة جديدة.

قم بتنمية الخلايا عند 30 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز بسرعة 220 دورة في الدقيقة حتى تصل إلى منتصف مرحلة السجل. عندما تصل الثقافات إلى منتصف مرحلة السجل ، أضف 2.7 مل من 37٪ فورمالديهايد مباشرة إلى الوسط في كل قارورة للحصول على تركيز نهائي قدره 1٪ فورمالديهايد. انقل القوارير إلى شاكر في درجة حرارة الغرفة ، ورج عند 50 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة.

أضف خمسة ملليلتر من 2.5 مولار جلايسين إلى الوسط واستمر في الرج عند 50 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق لإرواء الفورمالديهايد. بعد ذلك ، قم بتدوير الخلايا وغسلها كما هو موضح في بروتوكول النص. قم بإزالة المادة الطافية بعد الدوران الأخير واستمر في صنع الخميرة.

أعد تعليق الخلايا في مليلتر واحد من الترسيب الأميني للكروماتين البارد أو المخزن المؤقت لتحلل ChIP مع 1 مللي مولار PMSF وتخفيف 1: 1000 من كوكتيل مثبط البروتياز الخميرة. انقل التعليق إلى أنبوب غطاء لولبي سعة 2.0 مليلتر يحتوي على 200 ميكرولتر من الخرز الزجاجي. انقل الخلايا إلى جهاز ضرب الخرز لتحريك عالي السرعة عند أربع درجات مئوية.

يخفق الخرز لمدة 30 ثانية والثلج لمدة دقيقة واحدة. ضرب الخرزة ما مجموعه ست مرات ، مع إبقاء الخلايا على الجليد لمدة دقيقة واحدة على الأقل بين كل 30 ثانية من الضرب. باستخدام طرف تحميل الجل ، انقل المحللة إلى أنبوب سعة 1.5 مل.

الطرد المركزي المحللة عند 15 ، 500 جم عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت لهضم نوكلياز المكورات الدقيقة عن طريق سحب العينة برفق لأعلى ولأسفل. أضف 2.5 ميكرولتر من نوكلياز المكورات الدقيقة إلى كل تفاعل.

تخلط برفق عن طريق التقليب أربع إلى ست مرات وتحتضن على الفور في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد 20 دقيقة ، أوقف التفاعل عن طريق وضع الأنابيب على الجليد ، وإضافة خمسة ملليلتر من 0.5 مولار EDTA للحصول على تركيز نهائي يبلغ 10 ملليمولار EDTA والخلط برفق عن طريق الانعكاس. جهاز طرد مركزي عند 15 ، 500 جم عند أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.

ثم انقل كل مادة طافية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل. للحصول على النتائج الأكثر اتساقا ، من الأهمية بمكان التأكد من استخدام نفس تركيز البروتين في كل ترسيب أميني. اعتمادا على عدد الترسيب الأميني أو تفاعلات IP ، قم بعمل مزيج رئيسي من كل نوكلياز مكورات دقيقة تم إطلاقه من جزء الكروماتين ومخزن تحلل ChIP وخصص ملليلترا واحدا يحتوي على 50 ميكروغراما من البروتين الكلي للأنابيب الفردية.

قم بإزالة 100 ميكرولتر من كل مزيج IP لمعالجته كعينة إدخال. قم بتجميد عينات الإدخال عند 20 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا. من المهم أيضا التأكد من استخدام نفس الكمية من الخرزات المرتبطة بالجسم المضاد لكل ترسيب مناعي.

باستخدام طرف ماصة عريض ، أضف 20 ميكرولترا من حبات AG البروتينية المغناطيسية ، مربوطة مسبقا بجسم مضاد لكل عينة IP. قم بتدوير العينات عند ثمانية دورات في الدقيقة عند أربع درجات مئوية لمدة ثلاث ساعات. عند الانتهاء من IP ، ضع الأنابيب في حامل مغناطيسي واترك الخرز يتجمع على جانب الأنبوب.

استخدم ماصة لإزالة المادة الطافية. أضف ملليلترا واحدا من المخزن المؤقت لتحلل ChIP إلى الخرزات وقم بتدويرها عند ثمانية دورات في الدقيقة عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. ثم ضع الأنابيب على الحامل المغناطيسي وقم بإزالة المادة الطافية.

بهذه الطريقة ، اغسل الخرزات على التوالي باستخدام المخازن المؤقتة التالية لعدد المرات المشار إليها. مخزن تحلل ChIP ، عازلة غسيل عالية الملح ، مخزن غسيل LiCl / منظف و TE. مع آخر غسول TE ، استخدم 0.5 مل من TE لنقل معظم الخرزات إلى أنبوب جديد ، ثم استخدم 0.5 مل أخرى من TE لغسل الأنبوب ونقل الخرزات المتبقية. أضف 250 ميكرولترا من المخزن المؤقت للشطف ChIP الطازج إلى كل أنبوب وقم بتدوير المحلول لفترة وجيزة.

قم بتدوير العينات عند ثمانية دورات في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. ضع الأنابيب في الحامل المغناطيسي. انقل المادة الطافية بعناية إلى أنبوب جديد وتجنب الخرز.

أضف 250 ميكرولترا أخرى من المخزن المؤقت للشطف ChIP إلى الخرز. قم بتدوير العينات عند ثمانية دورات في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بعناية ودون إزعاج الخرزات ، انقل المادة الطافية إلى الأنبوب الذي يحتوي على الشطف الأول.

قم بإذابة عينات الإدخال التي تم جمعها مسبقا وأضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت لشطف ChIP إلى كل عينة إدخال. لعكس الروابط المتقاطعة للحمض النووي للبروتين ، أضف إلى كل من عينات المدخلات و IP ، 20 ميكرولترا من خمسة كلوريد الصوديوم المولي ، وخمسة ميكرولترات من الجليكوجين و 12.5 ميكرولتر من البروتيناز K. احتضان العينات في حمام مائي 65 درجة مئوية طوال الليل.

لبدء هذا الإجراء ، قم بعمل مزيج رئيسي QPCR لكل مجموعة من البادئات من خلال الجمع بين الأحجام المناسبة لمزيج QPCR ، والتمهيدي الأمامي ، والتمهيدي العكسي. قم بعمل خلطات رئيسية من الحمض النووي لكل عينة من الحمض النووي حيث يحتوي تفاعل واحد على 0.5 ميكرولتر من الحمض النووي و 4.0 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز أضف 5.5 ميكرولتر من مزيج التمهيدي الرئيسي المناسب لكل بئر في لوحة QPCR سعة 384 بئر. قم بتدوير الطبق على حرارة 200 جم في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة.

ثم أضف 4.5 ميكرولتر من مزيج الحمض النووي الرئيسي المناسب لكل بئر. أغلق الطبق ، وقم بتدويره على حرارة 200 جم في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. قم بإجراء QPCR باستخدام نظام QPCR في الوقت الفعلي بالشروط التالية ، 95 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق ، و 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان و 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ومنحنى انصهار من 65 درجة مئوية إلى 95 درجة مئوية بزيادات قدرها 0.5 درجة مئوية لمدة خمس ثوان.

يتمثل أحد المكونات الرئيسية لهذا البروتوكول في تحسين تركيز نوكلياز المكورات الدقيقة المستخدمة لهضم الكروماتين إلى شظايا قابلة للذوبان. يظهر هذا المثال الناتج عن الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز للحمض النووي المعزول بعد هضم حبيبات الكروماتين بكميات متفاوتة من نوكلياز المكورات الدقيقة أن 2.5 ميكرولتر من الإنزيم عند 20 وحدة لكل ميكرولتر ينتج في الغالب أحادي النوكليوسومات. استخدمت تجربة ChIP التمثيلية هذه أجساما مضادة ضد علامة ميثيل هيستون H3K4me2 و histone H3 في الخلايا القاضية من النوع البري و set1.

تفتقر خلايا الضربة القاضية Set1 إلى ترانسفيراز الميثيل الذي يحفز العلامة تشير الأشرطة إلى التخصيب النسبي ل H3K4me2 عند العلوم المنخفضة المشار إليها. أظهرت سلالة النوع البري تخصيبا واضحا ل H3K4me2 في الطرف الخمسة الرئيسي لجينين معروفين بأنهما أهداف مباشرة للمجموعة 1 و PMA1 و ERG11 بينما لم يتم ملاحظة أي إشارة في خلايا الضربة القاضية set1. كما هو متوقع ، لم يكن هناك تخصيب لعلامة H3K4me2 في TEL07L ، كما تم الإبلاغ عن التعبير عن SPR3 ليتم تنظيمه بواسطة set1 ولكن هذه النتائج تشير إلى أن التنظيم من المحتمل أن يحدث بآلية مختلفة عن PMA1 أو ERG11.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون أربعة أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر اختبار الجسم المضاد المستخدم بعناية للتأكد من نوعه باستخدام الضوابط المناسبة. إذا كان ذلك متاحا ، يجب فحص مناطق التحكم الإيجابية والسلبية في QPCR.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن أيضا إجراء طرق أخرى مثل تسلسل GP من أجل تحديد الجينوم عن طريق توزيع تعديلات الهيستون. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اكتشاف مستويات تعديلات الهيستون المختلفة باستمرار في المناطق الجينومية الفريدة من خلال تجارب يتم التحكم فيها جيدا.