تجفف الدم والبقع المصل كأداة مفيدة لتخزين نموذج لتقييم المؤشرات الحيوية السرطان

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في البحوث الانتقالية مثل فرصة دراسة المؤشرات الحيوية في المرضى من البلدان النامية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي إمكانية تخزين عينات الدم والمصل لمدة أسبوعين على الأقل دون تجميد وتوفير مواد عالية الجودة للتحليل النهائي مثل qPCR و ELISA. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى تشخيص أمراض مثل السرطان والأمراض المعدية.

يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة في مجالات التشخيص أو البحث مثل دراسة أمراض ما قبل الولادة أو تحليل الأمراض المعدية مثل فيروس نقص المناعة البشرية. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما بدأنا في مقارنة المؤشرات الحيوية بين سلسلة حالات قوقازية وأفريقية لم تكن العينات المجمدة متوفرة لها. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطوات اكتشاف الدم.

في هذا الإجراء ، يتم جمع ثلاثة ملليلتر من عينة الدم في أنبوب سعة ثلاثة ملليلتر مع 5.4 ملليغرام من EDTA. اكتب رقم رمز المريض في الزاوية اليمنى السفلية من بطاقة التوفير. أعد تعليق الدم بعناية باستخدام ماصة سعة خمسة ملليلتر.

بعد ذلك ، قم بنقل بقعة واحدة من الدم إلى بطاقة التوفير. باستخدام طرف جديد لكل حصة دم ، كرر الإكتشاف للحصول على ما مجموعه ثلاث إلى خمس بقع دموية. اترك بقع الدم الجافة ، أو DBS ، لتجف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة مع فتح غطاء بطاقة التوفير في وضع أفقي على سطح مفتوح غير ماص وتجنب أشعة الشمس المباشرة.

في اليوم التالي ، قم بتخزين البطاقة في درجة حرارة الغرفة في كيس بلاستيكي مع مجفف حتى الاستخدام. سيتم استخراج الحمض النووي من ثلاث بقع دم جافة من بطاقة التوفير. ابدأ بقص كل DBS من البطاقة وفصلها عن البطاقة.

قطع DBS المنفصلة إلى قطع صغيرة يبلغ قطرها حوالي ملليمتر واحد. ضع القطع الصغيرة من DBS واحد في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 ملليلتر. لهضم العينات ، أضف إلى الأنبوب 180 ميكرولترا من المخزن المؤقت للتحلل واحدا من مجموعة استخراج الحمض النووي المتوفرة تجاريا ، ثم أضف 20 ميكرولترا من البروتيناز K.Mix عن طريق الدوامة.

ضع الأنبوب في حاضنة حرارية واحتضنه مع الرج عند 56 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. في نهاية الحضانة ، قم بعمل الطرد المركزي للأنبوب لفترة وجيزة لإزالة القطرات من الغطاء. ابدأ الغسيل بإضافة 200 ميكرولتر من محلول التحلل المخزن المؤقت الثاني والدوامة لمدة 10 ثوان.

ضع الأنبوب في خلاط حراري واحتضنه على حرارة 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ضع عمود المراوغة في أنبوب تجميع جديد سعة ملليلترتين وتخلص من العمود القديم. أضف 500 ميكرولتر من محلول الغسيل والطرد المركزي عند 6000 ضعف الجاذبية لمدة دقيقة واحدة.

ضع العمود في أنبوب تجميع جديد سعة ملليلترين وتخلص من الأنبوب القديم. أضف 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل الثاني وجهاز الطرد المركزي عند 6000 ضعف الجاذبية لمدة دقيقة واحدة. ضع العمود في أنبوب تجميع جديد سعة ملليلترين وتخلص من الأنبوب القديم.

جهاز الطرد المركزي عند 20 ، 000 مرة الجاذبية لمدة ثلاث دقائق لتجفيف الغشاء. لتصفية الحمض النووي ، ضع العمود في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 مليلتر وتخلص من أنبوب التجميع. ضع 50 ميكرولترا من الماء المقطر في وسط الغشاء واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 20 ، 000 مرة من الجاذبية لمدة دقيقة واحدة. اجمع العجينة وضعها مرة أخرى في وسط الغشاء. الطرد المركزي الأنبوب مرة أخرى عند 20،000 مرة الجاذبية لمدة دقيقة واحدة.

تجاهل الغشاء. بعد قياس تركيز الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي ، قم بتخزين الحمض النووي عند 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام. في هذا الإجراء ، يتم جمع سبعة ملليلتر من عينة الدم المحيطية أولا في أنبوب سعة سبعة ملليلتر بدون EDTA.

اترك عينة الدم لتتخثر في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. اكتب رقم رمز المريض في الزاوية اليمنى السفلية من بطاقة التوفير. الطرد المركزي عينة الدم عند 1100 مرة الجاذبية في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.

قم بإزالة المادة الطافية من الأنبوب وانقله إلى أنبوب جديد سعة 15 مل. أعد تعليق الدم بعناية باستخدام ماصة سعة خمسة ملليلتر. ماصة وانقل بقعة واحدة من المصل إلى بطاقة التوفير.

كرر الإكتشاف للحصول على ما مجموعه ثلاث إلى خمس بقع دموية. اترك بقع المصل المجففة لتجف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة مع فتح غطاء بطاقة التوفير. في اليوم التالي ، قم بتخزين البطاقة في درجة حرارة الغرفة في كيس بلاستيكي مع مجفف حتى الاستخدام.

إذا كان التخزين أطول من 14 يوما ، فقم بتخزينه في درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. استعد لمقايسة ELISA عن طريق إذابة DSS لكل عينة إذا لزم الأمر. لتخلص البروتين من DSS ، قم بتقطيع DSS إلى قطع صغيرة يبلغ قطرها حوالي ملليمتر واحد وضع القطع في أنبوب 1.5 ملليلتر.

ثم أضف أربعة ميكرولترات من PBS. رج العينات بسرعة منخفضة عند أربع درجات مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، استخدم مخففا مناسبا للبروتين المضطرب كعينة مصل لتحليل البروتين المفرز أو عامل النمو باستخدام مجموعة متوفرة تجاريا.

في هذا البروتوكول ، تم تخزين عينات الدم والمصل كبقع جافة على ورق ترشيح في درجة حرارة الغرفة. يتم عرض بطاقة توفير البروتين التمثيلية قبل أخذ عينات الدم وبعده. من أجل التأكد من أن التخزين على ورق الترشيح وإجراء تصفية الدم لا يتداخل مع جودة العينة ، تم إجراء فحوصات ELISA لبروتين ربط فيتامين (د) ، أو مستويات DBP ، على ثماني عينات من المصل تم جمعها في أنبوب ملليلتر وتخزينها على الفور عند 80 درجة مئوية تحت الصفر أو جمعها كبقع مصل جافة.

تراوح معامل التباين ، أو السيرة الذاتية ، بين العينات المتطابقة من 2٪ إلى 24٪ وكان متوسط السيرة الذاتية 9.6٪ بمجرد إتقان هذه التقنية ، يمكن القيام بهذه التقنية في 10 أو 15 دقيقة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق المجرى للبيولوجيا الجزيئية أو تحليل البروتين. بعد تطويرها ، تمكن هذه التقنية البحث في مجال البحث الانتقالي وتحليل المؤشرات الحيوية من التعاون مع معاهد من جميع أنحاء العالم لا تملك معدات المختبر لتخزين العينات البيولوجية في ظروف قياسية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تخزين عينات الدم بشكل صحيح في الدم الجاف وبقع المصل. لا تنس أن العمل مع الدم والكاشف الكيميائي يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات ومعطف المختبر أثناء تنفيذ هذا الإجراء.