Name: مقايسة Burrowing/النفقي الكشف عن نقص في اليرقات melanogaster المورفولوجية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: تعلم كيفية اكتشاف نقص الأكسجين في أنسجة يرقات ذبابة الفاكهة Drosophila melanogaster باستخدام مقايسة النفق السلوكية. تساعد هذه الطريقة الباحثين على تمييز اليرقات المحتاجة للأكسجين عن الطفرات الأخرى ذات النمو البطيء.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وكانت كارين م. تشيانغ متلق 2016 جائزة جورج ج. شروبفير البحوث في جامعة رايس. زهو فانلي هي المستفيدة من زمالة التدريس من جامعة رايس. خدمات مركز الأسهم المورفولوجية بلومينغتون، مرفق "رحلة جامعة هارفارد"، مركز الموارد المورفولوجية فيينا العرفان.

1-إعداد اليرقات
<ol><li>أيام أو أكثر قبل البدء التحليل، إعداد الصلبان من المطلوب التجريبية والتحكم في مجموعات (الحد الأدنى 20 الإناث والذكور 10 كل) في أطباق البيض-تكمن كما وصفت ف. فيشاوس فازوا ونوسلاين-فولهارد 13 ولكن باستخدام 50 مل بولي بروبلين سم 6.0 المتاح أطباق بيتري المحتوية على أجار العنب ولطخت مع الخميرة وقنينة لصق فقط قبل الاستخدام. يبقى الذباب في أطباق البيض-يكمن في الظلام في درجة حرارة الغرفة حتى حاجة.</li>
	<li>وصفه أجار العنب – الجمع بين 100 مل المجمدة 100% العنب عصير التركيز، 350 مل من الماء ديوينيزيد، 5 مل الجليدية الخليك و 13 ز melanogaster دال- أجار في كوب زجاج 1 لتر. الموجات الدقيقة في رشقات نارية 1-2 دقيقة، مع التحريك بين رشقات نارية، حتى يذوب كل أجار. بارد الحل لبضع دقائق ثم أضف 10 مل من 10% (w/v) من نيباجين (الميثيل-فهيدروكسيبينزواتي) في الإيثانول 95%. مزيج، ثم ماصة 7 مل كل لوح في أطباق بتري سم 6.0 القابل للصرف، تسمح لجل وجاف في درجة حرارة الغرفة حاء 3-4 مخزن في 4 ج 0 في أكياس من البلاستيك.</li>
	<li>لصق الخميرة وصفه – الخميرة ز 7 المجففة، منزوع 10 مل من الماء، تخلط مع ملعقة حتى الاتساق موحد.</li>
	<li>مجموعات البيض لتوليد تجريبية ومراقبة اليرقات في الوقت المناسب. استخدام جديد، لوحات لطخت الخميرة، والعنب، جمع البيض في درجة حرارة الغرفة ح 4 في الظلام خلال ساعات الصباح. إزالة هذه اللوحات جمع ح 4 واستبدالها بلوحات جديدة. احتضان ح 4 لوحات جمع بين عشية وضحاها في 25 0ج حتى بعد ظهر اليوم التالي، عندما سيكون قد دبرت معظم اليرقات. جمع هذه يرقات الطور الأول واستخدامها لإعداد هذه التجربة.</li>
</ol>2-إعداد لوحات الفحص
<ol><li>إعداد لوحات المقايسة. لتشغيل واحدة من المقايسة، إعداد خمس المقايسة لوحات كل 10 يرقات التجريبية وخمس لوحات من 10 مراقبة اليرقات. استخدام حفار فلين 1.5 سم إزالة نواة مركزية من أجار من كل لوحة إنشاء حفرة للطعام. وضع الخميرة لصق (0.8-0.9 g) في الحفرة وبات بلطف مع ملعقة جعل التلة ملء الحفرة.</li>
	<li>إعداد لوحة أجار – الجمع بين منزوع 700 مل من الماء مع ز 16 د melanogaster أجار في كوب زجاج 2 لتر والميكروويف لدقيقة 5 إزالة من الميكروويف ويقلب بقضيب زجاج لإحضار أجار أونديسولفيد إلى الحل. إضافة 17.5 مل 10% (w/v) نيباجين في 95% إيثانول، ميكس، ثم تستمر تدفئة تعمل بالموجات الدقيقة في 30 ثانية رشقات نارية متبوعاً بالتحريك، حتى يذوب جميع أجار تماما. باردة لمدة دقيقة أو اثنتين، ثم "الماصة؛" مختبرين 15 مل في أطباق بتري البلاستيك 10 سم. تسمح أجار هلام، تغطي لوحات مع أغطية والسماح لهم الجافة في درجة حرارة الغرفة لبضع ساعات أو بين عشية وضحاها. تخزين لوحات في أكياس بلاستيكية محكمة الإغلاق عند 18 درجة مئوية. ملاحظة 1: لتجنب تكوين بلورات نيباجين على سطح اللوحات بسبب ديسيككيشن الزائدة، استخدام لوحات في غضون بضعة أيام من التحضير. إذا لزم الأمر، ويمكن إعادة حل البلورات بإسقاط ميكروليتيرس عدد قليل من الكحول 95% لهم. 2 ملاحظة: دفعات أجار يمكن لها خصائص التبلور مختلفة. ينبغي أن تكون لوحات جافة هلام الراسخ للمس ومرنة بما فيه الكفاية أن دائرة نظيفة وسليمة لاجار يمكن إزالتها عند استخدام حفار الفلين لخلق ثقب الأغذية (انظر أعلاه).</li>
	<li>إعداد اليرقات في لوحات المقايسة. استخدام الضغط الميكانيكي لمنحنى غيض من ميكروسباتولا البلاستيك وتراجع الطرف في لصق الخميرة لتوفير "لاصقة" لالتقاط اليرقات. التقاط يرقات الطور الأول على حدة ووضعها على لوحة أجار قريبة من التلة الغذاء. إعداد لوحات تكرار خمسة على الأقل 10 يرقات لكلا تجريبية ومراقبة الأنماط الجينية. وبمجرد الانتهاء، كاب وتسمية كل لوحة ومجموعة اللوحات (غطاء الوجه لأعلى) في مساحة مظلمة في درجة حرارة الغرفة (في مختبر لدينا هذا 22 درجة مئوية).</li>
</ol>3-رصد لوحات الفحص
<ol><li>دراسة لوحات يوميا تحت مجهر تشريح وسجل عدد اليرقات على رأس المواد الغذائية أو على سطح أجار. ملاحظة أي يرقات ميت أو يحتضر مرئية. ملاحظة عندما، وإذا كان الاتصال النفقي في التحتية أجار يعتبر نقل اليرقات إلى الطور الثالث. ملاحظة التواريخ التي تبدأ بشكل الخوادر وملاحظة أي شذوذ الخوادر. متابعة الملاحظات اليومية حتى جميع اليرقات وقد توفي أو بوباتيد.</li>
	<li>إزالة الخوادر بعناية من اللوحة مع بنت إغاظة إبرة ونقل إلى طبق عنب. إذا رغبت في ذلك، مواصلة رصد الخوادر لتحديد كم عدد اكلس كبالغين.</li>
</ol>4-إعداد المقايسة ألواح للتصوير
<ol><li>إزالة وتجاهل جميع الأغذية الخميرة من البئر المركزية لكل لوح بعناية.</li>
	<li>بلطف الفيضانات في كل لوح بماء الصنبور واستخدام فرشاة الطلاء فنان لينة بعناية فرك قبالة الحطام التي قد تم تعقبها إلى سطح أجار. استبدال الماء عدة مرات وتستمر لطيف بالفرشاة حتى تصبح كل لوحة نظيفة تماما. تعطي لوحات من شطف نهائي مع المياه وكاب لهم وترك في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها إلى جفاف. ملاحظة: نفق إلى أجار الأكثر كثافة حول التلة الغذاء (انظر الشكل 2). كنتيجة لذلك، عادة ما يتم توسيع حافة حفرة الغذاء يتجاوز قطرها 1.5 سم الأولى. وبالإضافة إلى ذلك، قد يسبب هشاشة أجار عملت في هذه المنطقة القطع الصغيرة من أجار النفقية إلى فقدان من محيط الحفرة أثناء التنظيف. زيادة تركيز جل أجار يمكن أن يساعد مع هذه المشاكل، لكن تصحيحات ممكنة خلال الخطوات كوانتيتيشن "ي الصورة" (انظر أدناه).</li>
</ol>5-كوانتيتيشن للاتصال النفقي
<ol><li>صورة اللوحات. تحضير صورة لكل لوح تؤخذ على خلفية سوداء من أجل إظهار الإنفاق في أجار كخطوط بيضاء مشرقة. ملاحظة: ونحن نستخدم نظام يستخدم عادة للصورة الهلامية الحمض النووي لهذه الخطوة (انظر الجدول للمواد والمواد الكاشفة). ويمكن تعديل بديل قادر على توليد ملفات tiff، مثل الكاميرات الرقمية أو كاميرات الهاتف الخليوي نظم التصوير لإنتاج صور مناسبة.</li>
	<li>استخدام برنامج المشاع "ي صورة المعاهد الوطنية للصحة" إلى كوانتيتاتي أنفاق اليرقات. تحميل البرنامج من http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. لمزيد من المعلومات حول البرنامج اذهب إلى http://imagej.nih.gov/ij/docs/intro.html. ملاحظة: يمكن استخدام نظم التصوير الأخرى كوانتيتاتي الاتصال النفقي. تنطبق الإرشادات الموجودة أدناه إلى "المعاهد الوطنية للصحة صورة ياء."</li>
	<li>بعد فتح صورة ملف tiff من صفيحة نفق، استخدم أداة البيضاوي لتعريف منطقة كوانتيتيشن التي تمثل السطح أجار كامل ولكن المحاصيل خارج حافة اللوحة بلاستيكية.</li>
	<li>تطبيق الحد الأدنى التلقائي لإنتاج صورة معكوسة اللوحة، مع أنفاق تظهر كخطوط سوداء. استخدام منتقي الألوان وأدوات الرسام إلى اللون الأبيض خارج أي المناطق السوداء التي تمثل ضررا لاجار بدلاً من الإنفاق.</li>
	<li>إطار تحليل القائمة المنسدلة، حدد مقياس مجموعة | انقر لإزالة الجدول ثم في الإطار تعيين قياسات (أيضا في إطار تحليل)، تحقق من المنطقة و الحد الأقصى لعتبة.</li>
	<li>اضغط على مفتاح Cntrl + المفتاح M لإظهار منطقة سوداء (الإنفاق) بالبكسل.</li>
	<li>نسخ ولصق قيمة بكسل لكل لوحة إلى برنامج جدول بيانات (مثل Excel) التي ستسمح للتحليل الكمي.</li>
	<li>عادة ما يتم توسيع الثقب المركزي سبب نفق مكثفة في هذه المنطقة. كوانتيتاتي نفق مفقود، قم بإلغاء تحديد "الحد إلى عتبة" واستخدام أداة العصا لتعريف ثقب مركزي. اضغط على مفتاح Cntrl + المفتاح M الحصول على قيمة بكسل في هذا المجال. استقطاع من هذه القيمة قيمة بكسل حفرة 1.5 سم وإضافة الفرق إلى نفق القيمة التي تم الحصول عليها في الخطوة 5، 6.</li>
	<li>قد يفتقد ثقب مركزي لبعض اللوحات، قطعة من أجار النفقية التي تشمل منطقة أجار أونتونيليد المتاخمة للثقب. عندما كوانتيتاتينج ثقب مركزي لهذه استخدام لوحات منتقي الألوان والطلاء فرشاة أدوات لإضافة شريط أسود عبر المنطقة مفقود لتعريف منطقة النفق واستبعاد المنطقة غير نفق من كوانتيتيشن. ملاحظة 1: إذا اليرقات تجريبية تنفذ أي نفق، يسمح هذا كوانتيتيشن حساب متوسط نفق القيم لمجموعات من لوحات ومقارنة إحصائية للتحكم والقيم التجريبية.</li>
</ol>

<ol><li>O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+responses+to+oxygen+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Conserved responses to oxygen deprivation.</a> J. Clin. Invest. 107 (6), 671-673 (2001).</li>
<li>Lavista-Llanos, S., et al. <a target="_blank" href="http://mcb.asm.org/content/22/19/6842.full">Control of the hypoxic response in D. melanogaster by the basic helix-loop-helix pas protein Similar.</a> Mol. Cell. Biol. 22 (19), 6842-6853 (2002).</li>
<li>Reiling, J. H., Hafen, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC534649/">The hypoxia-induced paralogs Scylla and Charybdis inhibit growth by down-regulating S6K activity upstream of Tsc in D. melanogaster.</a> Genes Dev. 18 (23), 2879-2892 (2004).</li>
<li>Gorr, T. A., Gassmann, M., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+and+responding+to+hypoxia+via+Hif+in+model+invertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Sensing and responding to hypoxia via Hif in model invertebrates.</a> J. Insect Physiol. 52 (4), 349-364 (2006).</li>
<li>Romero, N. M., Dekanty, A., Wappner, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17998052">Cellular and developmental adaptations to hypoxia: A D. melanogaster perspective.</a> Meth. Enzymol. 435, 123-144 (2007).</li>
<li>Dijkers, P. F., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+a+hypoxia-induced%2C+nitric+oxide-mediated+signaling+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.Cell%22%5BJournal%5D)">Dissection of a hypoxia-induced, nitric oxide-mediated signaling cascade.</a> Mol. Biol.Cell. 20 (18), 4083-4090 (2009).</li>
<li>Zhou, F., Qiang, K. M., Beckingham, K. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4975476/">Failure to burrow and tunnel reveals roles for jim lovell in the growth and endoreplication of the D. melanogaster larval tracheae.</a> PLOS ONE. 11, e0160233(2016).</li>
<li>Wingrove, J. A., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2754235/">Nitric oxide contributes to behavioral, cellular, and developmental responses to low oxygen in D. melanogaster.</a> Cell. 98 (1), 105-114 (1999).</li>
<li>Zhang, L., Ward, R. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19818339">Uninflatable encodes a novel ectodermal apical surface protein required for tracheal inflation in D. melanogaster.</a> Dev. Biol. 336 (2), 201-212 (2009).</li>
<li>Langlais, K. K., Stewart, J. A., Morton, D. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15159437">Preliminary characterization of two atypical soluble guanylyl cyclases in the central and peripheral nervous system of D. melanogaster melanogaster.</a> J. Expt. Biol. 207 (13), 2323-2338 (2004).</li>
<li>Morton, D. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3127060/">Behavioral responses to hypoxia and hyperoxia in D. melanogaster larvae.</a> Fly. 5 (2), 119-125 (2011).</li>
<li>Brand, A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Wieschaus, E., Nusslein-Volhard, C. Looking at embryos. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWieschaus%2C+E+%22Drosophila%3A+a+practical+approach%22">Drosophila: a practical approach</a>. Roberts, D. B. , IRL Press. Oxford and Washington DC. 199-227 (1986).</li>
<li>Callier, V., Shingleton, A. W., Brent, C. S., Ghosh, S. M., Kim, J., Harrison, J. F. <a target="_blank" href="http://jeb.biologists.org/content/216/23/4334">The role of reduced oxygen in the developmental physiology of growth and metamorphosis initiation in D. melanogaster.</a> J. Expt. Biol. 216 (23), 4334-4340 (2013).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23382692">Hif- and non-Hif-regulated hypoxic responses require the estrogen-related receptor in D. melanogaster.</a> PLoS genetics. 9 (1), e1003230(2013).</li>
<li>Grifoni, D., Sallazzo, M., Fontana, E., Froldi, F., Pession, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+strategies+of+oxygen+supply+in+Drosophila+malignancies+identify+tracheogenesis+as+a+novel+cancer+hallmark%5BTitle%5D)+AND+%22Scient.+Rep%22%5BJournal%5D)">Multiple strategies of oxygen supply in Drosophila malignancies identify tracheogenesis as a novel cancer hallmark.</a> Scient. Rep. 5 (9061), (2015).</li>
</ol>

ويعلن الكتاب لديهم لا تضارب المصالح المالية.

وقد قدمنا هنا مقايسة بسيطة مصممة للكشف عن نقص الأنسجة في اليرقات ميلانوجاستير د . يستند التشخيص تختبئ انخفض في أكوام المواد الغذائية في بداية حياة اليرقات وغياب التحتية نفق في أواخر الحياة اليرقات. مزاحمة اليرقات يمكن أن يسبب الهجرة المبكرة بعيداً عن مصدر لغذاء، وهكذا أحد الجوانب البالغة الأهمية في الفحص أن عددا صغيراً من اليرقات جزيئي حضور كبير لغذاء الزائد. إدراج نزوات هيدروكسيل ف الميثيل مبيد للفطريات (نيباجين) في لوحات أجار ضروري أيضا لمنع نمو العفن خلال المقايسة.
ونجد أن لوحات أجار يمكن أن تكون مصدرا لتقلب في المقايسة. نموذجياً، اليرقات من نفس النمط الوراثي، من دفعات مختلفة من الوالدين، أو من مجموعات مختلفة من اليرقات، تفاوتاً محدودة نسبيا في سلوكهم بالمقايسة. وفي المقابل، لوحات أجار في أيام مختلفة أو مع مجموعات مختلفة من أجار يمكن أن تؤدي الاختلافات في نفق. شرط واحد لذلك هو عنصر التحكم هذا واليرقات التجريبية ينبغي أن كل اختبار باستخدام لوحات أجار من إعداد المجموعة نفسها. أجار من مصنعين مختلفين أو الشحنات حتى من تصنيع نفس يمكن أن تختلف في قوتها التبلور، وحتى قد يكون من الضروري لضبط تركيز أجار صعودا من 2.2% المستخدمة هنا لتحقيق جل أمثل. وقد وجدنا أن سهولة يمكن أن تحفر اليرقات البرية نوع من خلال المواد الهلامية أجار 3%.
من أجل إبراز القيمة لهذا الفحص، وقد استخدمنا للتحقيق في احتمال نقص الأنسجة في اليرقات مع الدالة الممنوعة من أونينفلاتابل في تركي. النتائج التي توصلنا إليها تقديم دعم قوي للفرضية القائلة بأن فقدان التعبير الرغامى هذا الجين يمكن أن تنتج نقص: زجاجة-Gal4 > UAS-وحدة الاستخبارات المالية [رني] اليرقات أظهرت عدم تحفر في الغذاء، والغياب الكامل للاتصال النفقي التحتية خلال الطور الثالث. في دراساتنا السابقة للأنماط الجينية الأخرى، لاحظنا أن الخسائر الناجمة عن نقص في الغذاء تختبئ ليست كاملة مثل فقدان الاتصال النفقي التحتية و زجاجة-Gal4 > درس UAS-وحدة الاستخبارات المالية [رني] اليرقات هنا تصرفت على نحو مماثل. ولذلك توفر عنصر نفق الفاشلة لهذا الفحص إشارة أقوى من نقص.
على الرغم من أن زجاجة-Gal4 > واجهة المستخدمو [رني] اليرقات وأظهر الصفات السلوكية التشخيص من نقص، قطع(ue)-Gal4 > UAS-وحدة الاستخبارات المالية [رني] لا يحمل هذه التشوهات. زجاجة و قطع(ue) Gal4 برامج تشغيل يتم التعبير عنها في مراحل مختلفة، وفي أنماط مختلفة، داخل تركي اليرقات. زجاجة-أعرب عن سائق Gal4 في جميع أنحاء النظام الرغامى بدءاً من التنمية في امبريوجينيسيس ومستمرة من خلال حياة اليرقات. وفي المقابل، التعبير Gal4 من قطع(ue)-سائق Gal4 يبدأ في نهاية الحياة الجنينية، بعد morphogenesis تركي، ويقتصر على المقاطع الخلفي المتطرفة من جذوع الظهرية، سفن الطولية الرئيسية فقط النظام الرغامى. وحدة الاستخبارات المالية ضربة قاضية مع هذا الخط Gal4 قد لا يقلل ذلك التعبير وحدة الاستخبارات المالية وقت كاف أو على نطاق واسع يكفي لإنتاج بعض مستوى العتبة لنقص اللازمة لتحريك السلوكيات المقاسة في هذا التحليل.
دراسة سابقة وجدت أن يرقات الطور الثالث تتعرض لمستويات منخفضة من الأكسجين (10%) تظهر انخفاض النمو وتأخير ظهور بوبارييشن 14. زجاجة-Gal4 > UAS-وحدة الاستخبارات المالية [رني] اليرقات درس هنا تقدم إلى الطور الثالث ولكن آثار على معدلات النمو وبوبيشن وكانت أكثر وضوحاً: أنهم كانوا أصغر بكثير من الضوابط مع القليل جداً من الأنسجة الدهنية تحت وحاول بوبارييشن البشرة (الشكل 3) وسوى جزء طفيف (~ 10%). وتشير هذه الاختلافات إلى زجاجة-Gal4 > UAS-وحدة الاستخبارات المالية [رني] اليرقات شهدت قدرا أكبر من نقص، أما سبب ضربة قاضية وحدة الاستخبارات المالية في تركي كان حاضرا طوال حياتهم اليرقات كاملة، أو لأنها تنتج أكثر الحرمان من الأكسجين شديدة في الطور الثالث. كيف فقدان وظيفة وحدة الاستخبارات المالية في تركي قد يمنع نقل الأكسجين من غير الواضح في هذه المرحلة. تركي من زجاجة-Gal4 > UAS-وحدة الاستخبارات المالية [رني] اليرقات بالعيان من خلال بشرة (الشكل 3)، إشارة إلى أنهم الواردة الهواء وأضرار لا لدرجة أن دخول السائل للخطر الدالة. ولذلك فمن الممكن رسميا أن الرغامى الأضرار الناشئة عن فقدان وظيفة وحدة الاستخبارات المالية لا تحظى بنقص ولكن بدلاً من ذلك بعض الآخرين العيب الذي يمنع الاتصال النفقي. للأنماط الجينية التي درست سابقا، عقدنا العزم على أن الفشل في نفق يرتبط بمستويات مرتفعة من رابطة حقوق الإنسان مرناً7، المؤشر المعياري لتحلل ونقص في يرقات الطور الثالث مساء 15. وهكذا، تأكيد نهائي من نقص زجاجة-Gal4 > UAS-وحدة الاستخبارات المالية [رني] اليرقات (وفي يرقات درست في المستقبل استخدام هذا الفحص) ستشمل RT-PCR لتقييم مستويات مرناً رابطة حقوق الإنسان أو استخدام مؤشر المتاحة تجارياً لقياس مستويات الأوكسجين داخل الخلايا (انظر على سبيل المثال 16).

مجموعة متطورة من الأدوات الوراثية الجزيئية المتاحة في ميلانوجاستير دال- جعله كائناً قيماً لدراسة العمليات البيولوجية تقحم مصانة. أثبتت ردود الجزيئية الرئيسية على توافر الأكسجين تكون حفظت عبر تطور والدراسات السابقة في ميلانوجاستير دال- ولدت رؤى مكونات عالمية هذه الإشارات مسارات 1،2، 3،4،،من56.
كجزء من دراسة تهدف إلى تشريح وظيفة الخلايا العصبية الحسية في اليرقات ميلانوجاستير دال ، وحددنا اثنين من الردود السلوكية التي ثبت أنها تنشط بنقص الأنسجة في مستويات الأوكسجين العادي 7. واحدة من هذه، فشل تحفر في الغذاء، عالية تتصل بالاستجابة لمستويات الأوكسجين المنخفضة التي أبلغ عنها وينجروفي و O'Farrell 8. سلوك الثاني، الفشل في نفق إلى التحتية ناعمة أثناء الطور الثالث أواخر تجول المرحلة، لا سابقا حددت اعتبارها تتعلق بنقص. عقدنا العزم أن تعريض اليرقات تجول نوع البرية إلى مستويات منخفضة الأكسجين يمنع أيضا التحتية أنفاق 7، واضعين بذلك أن كل هذه السلوكيات تنشأ من نقص-أما الناجم عن تلف الأنسجة أو بمستويات استهلاك منخفضة الأكسجين. هنا يصف لنا مقايسة وقد وضعنا على كوانتيتاتي هذه السلوكيات التي يسببها نقص اثنين، الذي يبدأ مع الملاحظات مباشرة بعد الفقس اليرقات.
ردود التاكسج في المراحل المبكرة اليرقات لا درست سابقا وذلك إجراء تحليل طوال حياة اليرقات عنصرا قيماً في جهودنا المقايسة. أكثر المظاهر وضوحاً لنقص – بطء النمو وضعف النمو والركود الحركي – تتداخل مع اليرقات تعمل العديد من الطفرات التي تنتجها. ولكن وجدنا أن يرقات الطور الثالث فقط مع نقص إظهار فشل كامل نفق 7. وبذلك، عقدنا العزم أن اليرقات حتى أكثر للخطر من حيث النمو والحركة مما لدينا اليرقات التاكسج، لا يزال أداء بعض نفق، بينما اليرقات التاكسج ابدأ نفقية 7. وهكذا عنصرا قيماً آخر لهذا الفحص أنه يوفر طريقة لإنشاء عند نقص هو المصدر لمجموعة معينة من بليوتروبيك تعمل، بدلاً من بعض الإجهاد أو عطل الأيضية الأخرى. كبرهان المقايسة، هنا يصف لنا استخدامها في وصف ردود اليرقات مع انخفاض التعبير الرغامى من أونينفلاتابل، جين الذي يعمل في الخطوط الجوية اليرقات 9.
ونحن نتصور أن هذا التحليل سوف تكون ذات قيمة للباحثين المشاركين في وصف تعمل اليرقات التي تشمل ضعف النمو والسلوك بطيئا. كنتيجة، الجينات الجديدة التي تؤثر على التوزيع، أو استخدام، أو الردود، يمكن تحديد الأكسجين في جميع أنحاء الجسم. علاوة على ذلك، إدراج هذا التحليل في خافض فحص البروتوكول سيوفر طريقا مباشرا لتحديد الطفرات التي تنتج نقص. هذا التحليل سوف تكون أيضا قيمة في تحليل الدوائر الذي يتسبب في سلوك الفطرية التي يسببها نقص الموصوفة هنا. تحليل الشبكات العصبية من هذا النوع محط الكثير من البحوث الحالية والعصبي بسيطة لليرقة ميلانوجاستير دال- نظاما قيماً لتشريح من السلوكيات الآلي. الخلايا العصبية الحسية المشتركة في تصور الأكسجين اليرقات قد تم بالفعل تحديد، توفير خطوة أولى نحو تحديد الدوائر الكاملة للردود التي يسببها نقص 10،11. استخدام لدينا الإنزيم في تركيبة مع ضربة قاضية العصبية الانتقائي عبر نظام GAL4-UAS12 مسار واضح لتحديد مكونات الشبكة العصبية الأخرى.

<table><tbody><tr><td><قوي> الكواشف < / قوي ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>خميرة مجففة &nbsp ؛</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>عصير العنب المجمد المركز</td><td>Welch's</td><td></td><td>&nbsp; متوفر في معظم محلات السوبر ماركت الكبيرة</td></tr><tr><td>حمض الأسيتيك الجليدي</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>ذبابة الفاكهة أجار</td><td>أبيكس منتجات البحوث الحيوية</td><td>66-103</td><td></td></tr><tr><td>ميثيل بارا هيدروكسي بنزوات</td><td>أبيكس منتجات البحوث الحيوية</td><td>20-658</td><td></td></tr><tr><td><قوي>المعدات< / قوي></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 مل أكواب</td><td></td><td></td> بولي بروبلين<td></td></tr><tr><td>أطباق بتري يمكن التخلص منها 6.0 سم</td><td>صقر</td><td>08757100B</td><td></td></tr><tr><td>10 سم أطباق بتري بلاستيكية يمكن التخلص</td><td>منها E + K Scientific</td><td>EK-24104</td><td></td></tr><tr><td>ملاعق بلاستيكية ميكروسبواس</td><td>كورنينج إنكوربوريتد</td><td>3012</td><td></td></tr><tr><td>إبرة إغاظة عازمة</td><td>ناسكو</td><td>S08848MH</td><td></td></tr><tr><td>تشريح المجهر</td><td></td><td></td><td>أي مجهر مع 10-30X التكبير</td></tr></tbody></table>

"مقايسة" burrowing/النفقي "الكشف عن نقص" في اليرقات melanogaster المورفولوجية

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

يمكن أن يؤدي الحرمان من الأكسجين في الحيوانات من التعرض لمستويات منخفضة من الأكسجين الغلاف الجوي أو من تلف الأنسجة الداخلية الذي يتداخل مع توزيع الأوكسجين. من الممكن أيضا أن السلوك المنحرف للاستشعار الأكسجين من الخلايا العصبية يمكن أن تحفز السلوك مثل نقص وجود مستويات الأوكسجين العادي. في ميلانوجاستير دال، نتائج التنمية على مستويات منخفضة من الأوكسجين في تثبيط النمو والسلوك بطيئا خلال مراحل اليرقات. بيد هذه المنشأة مظاهر العجز الأكسجين تتداخل إلى حد كبير مع تعمل العديد من الطفرات التي تنظم النمو واستجابات الإجهاد أو الحركة. كنتيجة لذلك، لا يوجد حاليا لا مقايسة المتاحة لتحديد نقص ط) الخلوية التي يسببها طفرة أو السلوك الثاني) مثل نقص عند الناجمة عن سلوك الخلايا العصبية غير طبيعي.
ولقد حددنا مؤخرا اثنين السلوكيات المميزة في اليرقات melanogaster دال- التي تحدث في مستويات الأوكسجين العادي ردا على كشف داخلي من نقص. أولاً، تجنب هذه اليرقات في جميع المراحل، تختبئ في الغذاء، وكثيراً ما الضلال بعيداً عن مصدر لغذاء. ثانيا، نفق إلى التحتية ناعمة، التي تحدث عادة مرحلة الطور الثالث تجول هو يلغي كلياً إذا كانت اليرقات التاكسج. الفحص الموصوفة هنا يهدف إلى الكشف عن وكوانتيتاتي هذه السلوكيات ومن ثم لتوفير وسيلة للكشف عن نقص الناجمة عن الأضرار الداخلية بدلاً من الأوكسجين الخارجي منخفضة. لوحات المقايسة مع التحتية أجار والمكونات مركزية للصق الخميرة تستخدم لدعم الحيوانات من خلال حياة اليرقات. يتم تعقب مواقف والدولة من اليرقات يوميا كما أنها تنطلق من الطور الأول إلى الثالث. هو كوانتيتاتيد مدى الاتصال النفقي في التحتية أجار خلال المرحلة تجول بعد بوبيشن باستخدام إيماجيج المعاهد الوطنية للصحة. المقايسة سوف تكون ذات قيمة في تحديد متى يكون نقص مكون من النمط الظاهري متحولة وبالتالي توفر نظرة ثاقبة المواقع المحتملة لعمل الجينات في السؤال.

وإظهارا لقيمة هذا التحليل قد استخدمنا للتحقيق نقص محتمل في اليرقات بتلف في وظيفة الجينات أونينفلاتابل (وحدة المعلومات المالية) في تركي. وحدة ترميز بروتين transmembrane كبيرة التي يتم التعبير عنها بقوة على السطح قمي الخلايا الرغامى اليرقات. ولوحظت سابقا طفرات من وحدة الاستخبارات المالية يحمل السلوك الشاذة التي يمكن أن تشير إلى نقص الأنسجة بسبب عطل الرغامى 9. ونحن على وجه التحديد قمعت التعبير وحدة الاستخبارات المالية في القصبة الهوائية اليرقات باستخدام نظام Gal4-UAS. واستخدمت خطوط Gal4 اثنين: i) لاهث (زجاجة)-Gal4، التي يعبر عنها بشدة في تركي من البداية من التنمية الجنينية والثاني) قطع(ue)-Gal4، الذي يبدأ التعبير في منطقة الخلفية صغيرة من تركي الجذع الرئيسي الظهرية في نهاية امبريوجينيسيس وما زال التعبير القوى في هذه المنطقة طوال حياة اليرقات 7. وحصل UAS-وحدة الاستخبارات المالية [رني] خط من مركز أبحاث المورفولوجية فيينا (فدرك معرف #1050).
كما ورد في البروتوكول أعلاه، خمسة نسخ متماثل لوحات فقست حديثا الطور الأولى يرقات تم إعدادها لكل من الصلبان الأربع على النحو التالي.
تجربة 1 1) التحكم 1- قص(ue)-Gal4 x كانتون-S (+) 2) التجريبي 1- قص(ue)-Gal4 x UAS-وحدة الاستخبارات المالية [رني]
تجربة 2 3) مراقبة 2- زجاجة-Gal4 x كانتون-S (+) 4) التجريبي 2- زجاجة-Gal4 x UAS-وحدة الاستخبارات المالية [رني]
سلوك قطع(ue)-Gal4 &gt; UAS-وحدة الاستخبارات المالية [رني] يرقات 1 التجربة كانت مماثلة لتلك تحكم قطع(ue)-Gal4 &gt; + الحيوانات من حيث تختبئ ونفق والبقاء على قيد الحياة إلى بوبيشن، (الرقم 1 و الشكل 2). على النقيض من ذلك، تنظيم أسفل التعبير وحدة الاستخبارات المالية في جميع أنحاء النظام الرغامى بأكمله من وقت مبكر في التنمية (التجربة 2) تنتج استجابات تختلف اختلافاً كبيرا. زجاجة-Gal4 &gt; عرض UAS-وحدة الاستخبارات المالية [رني] يرقات كل مظاهر سلوكية من نقص الأنسجة – تخفيض تختبئ الغذاء وغياب الكامل للنفق في وقت لاحق في الحياة اليرقات(الشكل 1 و الشكل 2 التحتية ). أيضا اليرقات التجريبية ملحوظ أصغر حجماً وأقل سمكا وبطيئاً أكثر من عناصر التحكم (الشكل 3)، وأظهرت ارتفاع معدل الوفاة أثناء المقايسة. كما نوقش أعلاه، أن انخفاض النمو والركود والموت العضوي معروفة أعراض نقص اليرقات. وبالإضافة إلى ذلك، معظم اليرقات التجريبية فشلت محاولة بوبيشن وظلت إينستار ثالث اليرقات طويلة بعد مراقبة اليرقات قد بوباتيد. ونجا بعض اليرقات أكثر من 15 يوما قبل أن يموت في نهاية المطاف دون بوباتينج (الشكل 1A). حاول عدد قليل من اليرقات التجريبية بوبات ولكن في جميع الحالات شكلت الخوادر الشاذ الذي لم يولد الكبار قابلة للحياة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig1.jpg"> الشكل 1. كوانتيتيشن للتنمية الغذائية برجلهم واليرقات. (أ) النسبة المئوية لليرقات الحية خارج أكوام الطعام للأنماط الجينية أربعة دراستها هنا. يبين المتوسطات للمقايسة خمس لوحات المستخدمة لكل الوراثي. باليوم الثالث بعد الفقس، ~ 70% من زجاجة-Gal4 &gt; UAS وحدة الاستخبارات المالية [رني] اليرقات كانت خارج نطاق المواد الغذائية، بينما لم يتم اكتشاف لا يرقات خارج الطعام أو على سطح أجار للأنماط الجينية الثلاثة الأخرى. زجاجة-Gal4 &gt; UAS وحدة الاستخبارات المالية [رني] اليرقات يموت ببطء بين أيام 4-20، مع ~ 15% منهم لا يزال على قيد الحياة بعد الفقس 15 يوما. السهم الأسود على طول المحور س هنا وفي (ب) يشير إلى اليوم الذي قد بوباتيد جميع يرقات الوراثية الثلاث الأخرى. (ب) النسبة المئوية لليرقات ميتة مرئية خارج الطعام للأنماط الوراثية الأربعة. يبين المتوسطات للمقايسة خمس اللوحات لكل الوراثي. الميت زجاجة-Gal4 &gt; UAS وحدة الاستخبارات المالية [رني] اليرقات تتراكم على مر الزمن مع الموت معظم خارج الطعام. الأنماط الجينية الأخرى جميعا البقاء على قيد الحياة إلى بوبيشن (ج) نسبة البقاء على قيد الحياة إلى بوباتيون للأنماط الوراثية الأربعة درس. يبين المتوسطات للمقايسة خمس اللوحات لكل الوراثي. لا الخوادر العادي من زجاجة-Gal4 &gt; أنتجت UAS وحدة الاستخبارات المالية [رني] الوراثي. أشرطة الخطأ في جميع أنحاء الشكل تمثل SEMs. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig2.jpg"> الرقم 2. كوانتيتيشن من أنفاق اليرقات. (أ) أمثلة من لوحات الفحص لجميع الأنماط الوراثية الأربعة درس بعد التحضير لنفق كوانتيتيشن. يلاحظ غياب تام للاتصال النفقي زجاجة-Gal4 &gt; UAS وحدة الاستخبارات المالية [رني] اليرقات. لوحات المقايسة لوحات بيتري 10 سم. (ب) الاتصال النفقي كوانتيتيشن المستمدة من "ي صورة" للأنماط الوراثية الأربعة. متوسط قيم بكسل للمقايسة خمس اللوحات لكل الوراثي. لا يوجد نفق لوحظ زجاجة-Gal4 &gt; UAS وحدة الاستخبارات المالية [رني] اليرقات. أشرطة الخطأ = SEMs. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig3.jpg"> الشكل 3. مقارنة بين زجاجة-Gal4 &gt; UAS وحدة الاستخبارات المالية [رني] و زجاجة-Gal4 &gt; + اليرقات يرقات مماثلة لسن (يوم 6 بعد الفقس) زجاجة-Gal4 &gt; UAS وحدة الاستخبارات المالية [رني] (A) و زجاجة-Gal4 &gt; + (ب) الأنماط الجينية. الأسهم الحمراء تشير إلى تركي الجذع الظهرية. كلا اليرقات تصويرها في التكبير نفسه. شريط المقياس = 0.5 مم. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

ويصف البروتوكول مقايسة بسيطة التعرف على يرقات melanogaster المورفولوجية التي تعاني من نقص تحت مستويات الأوكسجين الغلاف الجوي العادي. ويسمح هذا البروتوكول اليرقات التاكسج ينبغي تمييز من طفرات أخرى تظهر متداخلة تعمل مثل الركود أو بطء النمو.

"مقايسة" Burrowing/النفقي "الكشف عن نقص" في اليرقات melanogaster المورفولوجية

Oxygen deprivation in animals can result from exposure to low atmospheric oxygen levels or from internal tissue damage that interferes with oxygen ...

الهدف العام من هذا الاختبار هو تحديد يرقات ذبابة الفاكهة التي تعاني من نقص الأكسجة في الأنسجة على الرغم من كونها في مستويات الأكسجين الطبيعية. في ذبابة الفاكهة ، هناك العديد من الطفرات التي تنتج نموا بطيئا وضعيفا لليرقات وبعض البطء في اليرقات. يحدد هذا الاختبار داخل تلك الفئة من اليرقات ، تلك التي تعاني من نقص الأكسجة في الأنسجة.في النهاية ، سيساعد هذا الاختبار في تحديد المزيد من الطفرات التي تنتج نقص الأكسجين في الأنسجة من خلال العمليات الفسيولوجية المختلفة. نشأت فكرة هذا الاختبار من ملاحظة أن اليرقات ذات المسالك الهوائية أو القصبة الهوائية التالفة أظهرت سلوكين غريبين. هذه السلوكيات غير الطبيعية هي الفشل في الحفر في الطعام خلال حياة اليرقات المبكرة والفشل في النفق في طبقة سفلية أكثر ليونة خلال مرحلة التجول.قم بإعداد التقاطعات الجينية التجريبية والتجريبية في أطباق وضع البيض كما هو موضح في بروتوكول النص. احتفظ بالذباب في الظلام لمدة يومين على الأقل قبل البدء في جمع البيض في الوقت المحدد. لجمع البيض في الوقت المناسب ، انقل البالغين إلى أطباق أجار العنب الجديدة المزينة بمسحة طازجة من معجون الخميرة في وقت مبكر من اليوم واسمح للبالغين بوضع البيض على الأطباق لمدة أربع ساعات.بعد أربع ساعات ، انقل البالغين إلى أطباق أجار العنب الطازجة. بعد ذلك ، احتضن لوحات التجميع لمدة أربع ساعات طوال الليل عند 25 درجة مئوية. بحلول بعد ظهر اليوم التالي ، ستكون معظم اليرقات قد فقست.خطط للحصول على 50 على الأقل لكل مجموعة تجريبية. لتشغيل واحد من الفحص ، قم بإعداد ما لا يقل عن خمس لوحات فحص لكل مجموعة تجريبية. أضف 16 جراما من فلاي أجار و 700 مل من الماء منزوع الأيونات عن طريق التسخين.تحضير 17.5 مل نيباجين في 95٪ من الإيثانول. سخني محلول الأجار حتى يذوب تماما تقريبا. ثم يضاف محلول Nipagen إلى محلول الأجار ويسخن حتى يذوب الأجار تماما.قم بتبريد محلول أجار لفترة وجيزة ، ثم قم بتحميل ألواح 10 سم ب 15 مل من محلول الأجار. بمجرد أن يصبح أجار جل ، ضع أغطية على الأطباق واتركها تجف في درجة حرارة الغرفة لبضع ساعات أو طوال الليل. يجب أن يكون الأجار المعالج صلبا عند اللمس ويقاوم الانهيار عند قطع القطع منه.بمجرد أن يجف الأجار ، استخدم لوح من الفلين بطول 1.5 سم لعمل ثقب مركزي في هلام الأجار في كل لوحة. ثم املأ الثقوب بدقة بمعجون الخميرة الطازجة. لنقل اليرقات إلى لوحة الفحص ، اصنع أداة بسيطة.ثني منحنى في طرف ملعقة بلاستيكية واغمس الحافة في عجينة الخميرة لجعلها لاصقة باليرقات. الآن التقط اليرقات الأولى بشكل فردي وضعها على طبق أجار بالقرب من كومة الطعام. لكل مجموعة تجريبية ، قم بإعداد ما لا يقل عن خمس أطباق ، كل منها يحتوي على 10 يرقات.لضمان قابلية التكرار بين تكرارات الفحص ، من الأهمية بمكان وضع 10 يرقات فقط على كل لوحة فحص. تأكد من فحص لوحة الفحص بعناية لتحديد أنه يتم نقل يرقة واحدة وواحدة فقط في كل مرة تقوم فيها بتسليم يرقة بطرف ملعقة دقيقة. بمجرد تحميل اللوحة ، قم بتسميتها ، وقم بتغطيتها ، ثم ضعها في الظلام مع وضع جانب الغطاء لأعلى في درجة حرارة الغرفة.افحص كل طبق يوميا حتى تموت جميع اليرقات أو تتحول إلى شرنق. فيما يلي أمثلة على لوحات سلالة من النوع البري لليوم الثاني حتى اليوم الثامن من الفحص. في اليوم الثاني ، يتم دفن اليرقات في الطعام ولا يحدث أي نفق.يبدأ حفر الأنفاق في اليوم الثالث ويصل إلى الحد الأقصى بين اليومين الخامس والثامن ، حيث تتوقف اليرقات عن التجول وتتشرنق في أنفاقها. انقل الشرانق بعناية بإبرة إغاظة مثنية إلى طبق العنب وإذا رغبت في ذلك ، احسب عدد الشرانق المحيطة. لاحظ تكوين الخادرة وقم بتقييم الشرانق بحثا عن التشوهات.لتصوير الأنفاق داخل لوحة الفحص ، قم أولا بإزالة جميع طعام الخميرة والتخلص منه بعناية من البئر المركزي لكل طبق. ثم قم بإغراق كل طبق برفق بماء الصنبور واستخدم فرشاة رسم ناعمة لفرك أي حطام تم تتبعه بعناية على سطح الأجار. قد تنهار بعض قطع الأجار حيث يكون حفر الأنفاق أكثر كثافة.يمكن تصحيح ذلك لاحقا. استمر في استبدال الماء عدة مرات وقم بتنظيف الحطام برفق حتى تصبح اللوحة نظيفة تماما. ثم اشطف الطبق نهائيا بالماء منزوع الأيونات ، وقم بتغطيته ، واتركه يجف في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.من المهم استخدام تدفق لطيف للمياه وضربات فرشاة لطيفة لتنظيف ألواح الأجار حتى لا تقطع أو تتلف أجزاء من جل الأجار. في اليوم التالي ، قم بإعداد صورة ملف tiff للوحة باستخدام خلفية سوداء لإظهار الأنفاق كخطوط بيضاء زاهية. تعمل أنظمة توثيق الجل بشكل جيد لهذه الخطوة.بعد ذلك ، قم بتحديد كمية النفق في الصورة باستخدام الصورة J باستخدام الأداة البيضاوية ، وحدد هلام الأجار حتى ، ولكن ليس بما في ذلك ، الحافة البلاستيكية للوحة بتري. ثم قم بتطبيق عتبة تلقائية لإنتاج صورة عكسية للوحة بحيث تظهر الأنفاق كخطوط سوداء. لتصحيح المناطق المظلمة التي لا تحتوي على أنفاق، استخدم أدوات منتقي الألوان وفرشاة الرسم لتبييض تلك المناطق.بعد ذلك ، ضمن القائمة المنسدلة تحليل ، حدد تعيين مقياس وانقر لإزالة المقياس. ثم انتقل إلى نافذة تعيين القياسات ضمن تحليل وفحص المنطقة والحد إلى الحد. الآن اضغط على مفتاح التحكم باستخدام المفتاح M للحصول على قياس للمنطقة السوداء في الصورة بوحدة البكسل التي تمثل المنطقة النفقية.لتقدير النفق المفقود من خلال تآكل الأجار حول الفتحة المركزية ، قم بإلغاء تحديد الحد إلى العتبة. استخدم أداة Wand لتحديد الفتحة المركزية واضغط على Control plus M لقياس قيمته بالبكسل. اطرح من هذه القيمة قيمة البكسل لثقب قطره 1.5 سم.أضف الفرق إلى قيمة البكسل التي تم الحصول عليها مسبقا لإعطاء إجمالي قيمة بكسل النفق. بالنسبة للصفائح التي يمتد فيها الأجار المفقود إلى ما وراء الحلقة المركزية للنفق ، من الضروري اتخاذ خطوة إضافية لمنع الكمية من تضمين مناطق خارج المنطقة الوسطى. استخدم أدوات Color picker و Paintbrush لإضافة شريط أسود كما هو موضح للحد من المساحة المحددة.تم استخدام الفحص الموصوف للتحقيق في نقص الأكسجة المحتمل في اليرقات مع ضعف وظيفة الجين غير القابل للنفخ في القصبة الهوائية. تم قمع الجين RNAi عبر Gal4 UAS. تم استخدام خطين Gal4.Breathless Gal4 ، والذي يعبر عن كل التطور في نظام القصبة الهوائية بأكمله. أو قطع (ue) Gal4 ، والذي يعبر بقوة في قسم قصبة هوائية صغير أثناء حياة اليرقات. احتوت يرقات التحكم على أحد خطوط Gal4 ، ولكن لا تحتوي على RNAi غير قابل للنفخ.لا يمكن تمييز اليرقات ذات القطع (ue) Gal4 التي تقود RNAi غير قابل للنفخ عن الضوابط طوال فترة التطور من حيث النمو والسلوك. ومع ذلك ، فإن القمع القوي للحمض النووي الريبي غير القابل للنفخ في جميع أنحاء القصبة الهوائية باستخدام blt-Gal4 أدى إلى الفشل في الحفر في مرحلة التغذية وأدى إلى ارتفاع معدل الوفيات. أظهرت هذه اليرقات أيضا غيابا تاما للنفق خلال مرحلة التجوال.علاوة على ذلك ، كانت يرقات Gal4 التجريبية التي لا تهاث أنفاسها أصغر وأرق وأكثر بطئا من الضوابط وظلت على شكل يرقات لفترة طويلة بعد أن تتشرنق جميع المجموعات الأخرى. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اختبار يرقات ذبابة الفاكهة لنقص الأكسجة في الأنسجة من خلال مراقبة مدى حفرها في أكوام الطعام أو النفق في طبقة سفلية ناعمة. يعد الغياب التام للنفق مؤشرا قويا على نقص الأكسجة في الأنسجة.

a-burrowingtunneling-assay-for-detection-hypoxia-drosophila

Research

JoVE Journal

Behavior

سلوك

ذبابة الفاكهة السوداء البطن هو وراثيا وسلوكيا نظام نموذج قابل للطرق التي استخدمت لفهم الأساس الجزيئي والخلوي من العديد من العمليات البيولوجية الهامة لأكثر من قرن 1. ذبابة الفاكهة قد تم استغلالها بشكل جيد للحصول على نظرة ثاقبة الأساس الجيني للسلوك الذباب.

طرق الفحص ذبابة الفاكهة سلوك

يوضح هذا الفيديو طريقة لاختبار نقص الأكسجة في ذبابة الفاكهة من خلال تقييم قدراتها على الحفر والحفر النفقي. باستخدام هذه التقنية ، يمكن للباحثين التمييز بين اليرقات التي تعاني من الحرمان من الأكسجين وتلك التي تعاني من عجز في النمو. يوضح مثال البروتوكول إعداد هذا الفحص.

ذبابة الفاكهة فحص الحفر والحفر النفقي: طريقة لتقييم نقص الأكسجة في الأنسجة في يرقات الذباب

يصف هذا الفيديو طريقة بسيطة لتحديد حركة الذباب ويظهر مقايسة التسلق التي تم إجراؤها. مقايسة تسلق الذباب هي اختبار عام للوظيفة الحركية التي تعتمد على استجابة جيوتاكس سلبية.

اختبار تسلق الذبابة: طريقة لاختبار الحركة العامة في ذبابة الفاكهة السوداء

Source:Siddarth Gunnala1, Nafisa M. Jadavji2,3,41Department of Biomedical Sciences, Midwestern University, Glendale, AZ, USA2Division of Integrative and Molecular Physiology, Department of Biomedical Sciences, Southern University of Illinois, Carbondale, IL, USA3Department of Child Health, College of Medicine Phoenix, University of Arizona, Phoenix, AZ, USA4Department of Neuroscience, Carleton University, Ottawa, ON, CanadaThis video demonstrates hypoxia-induced climbing behavior in Drosophila...

Hypoxia-Induced Climbing Behavior of Drosophila melanogaster

البشرة الجنينية من الأجنة مرحلة متأخرة جدا ذبابة الفاكهة يوفر نظام في الجسم الحي لتحليل استجابة ثقب الجرح سريعا ويمكن دمجها مع التلاعب الجيني أو علاجات حقن مكروي الكيميائية للمضي قدما دراسات في التئام الجروح للترجمة في نماذج الثدييات.

حقن مكروي الجرح الفحص و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; توطين البشرة الجرح مراسلون الاستجابة في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة.

نقدم هنا، وضع بروتوكول لتحديد درجة الحرارة البيئية المفضل لليرقات المورفولوجية استخدام تدرج حراري مستمر.

مقايسة تدرج درجة الحرارة لتحديد تفضيلات الحرارية يرقات المورفولوجية

نقدم بروتوكولا لقياس استهلاك الأوكسجين وتحمض خارج الخلية في العقول melanogaster المورفولوجية اليرقات والكبار. ويستخدم هو محلل ايضية مع بروتوكولا مدروسا والأمثل. القيود الأنسجة الدقيقة هي عنصر حاسم لهذا البروتوكول وصممت وأنشئت خصيصا لاستخدامها في هذا التحليل.

التحليل الأيضي اليرقات melanogaster المورفولوجية و "العقول الكبار"

تم تصميم هذا البروتوكول لتقييم صلاحية دروسوفيلا في كل مرحلة من مراحل النمو، من الجنين إلى الكبار. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد ومقارنة صلاحية مختلف الأنماط الجينية أو ظروف النمو.

طريقة مباشرة وبسيطة لتقييم قدرة دروسوفيلا ميلانوغاسترعلى البقاء من الجنين إلى الكبار

سلامة حاجز الدم في الدماغ أمر بالغ الأهمية لوظيفة الجهاز العصبي. في دروسوفيلا melanogaster، يتكون حاجز الدم في الدماغ من الخلايا الغليفية أثناء تكوين الجنين في وقت متأخر. يصف هذا البروتوكول طرق اختبار تكوين حاجز الدم في الدماغ وصيانته في أجنة D. melanogaster واليرقات النجمية الثالثة.

فحص لسلامة حاجز الدم في الدماغ في دروسوفيلا melanogaster

يقدم البروتوكول طريقة عالية الإنتاجية وفعالة من حيث التكلفة لتقييم السمية العصبية في ذبابة الفاكهة من خلال القياس الكمي للخلل الحركي كبديل لنماذج الثدييات التقليدية. يهدف إلى تقييم التأثيرات السامة للأعصاب للمركبات الصيدلانية أو العوامل البيئية أو التعديلات الجينية باستخدام نموذج حساس وقابل للتكرار ومفضل أخلاقيا.

التحليل السلوكي للخلل الحركي في ذبابة الفاكهة السوداء كقراءة للسمية العصبية

تعلم كيفية اكتشاف نقص الأكسجين في أنسجة يرقات ذبابة الفاكهة Drosophila melanogaster باستخدام مقايسة النفق السلوكية. تساعد هذه الطريقة الباحثين على تمييز اليرقات المحتاجة للأكسجين عن الطفرات الأخرى ذات النمو البطيء.

"مقايسة" Burrowing/النفقي "الكشف عن نقص" في اليرقات melanogaster المورفولوجية

استكشف المزيد من الفيديوهات