تكيف تهجين التقاط البروتينات المرتبطة بلونين للبروتينات في خلايا الثدييات

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في فهمنا لتنظيم الجينوم ، مثل كيفية تأثير متغيرات التسلسل المرتبطة بالمرض في المناطق غير المشفرة على التعبير الجيني وتنظيمه عن طريق تغيير ارتباط البروتين ، ويمكن أن تساعد في تحديد تلك البروتينات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها لا تتطلب أي نوع من التلاعب الجيني بالخلايا أو الأنسجة ، ولا الأجسام المضادة ، ولا معرفة مسبقة ببروتينات ربط الحمض النووي التي قد تتفاعل مع الحمض النووي في هذا الموضع. سيوضح هذا الإجراء دانو بيرومالا ، فني من مختبري.

بعد تصميم قليل النوكليوتيدات وفقا لبروتوكول النص ، لوحة 2 إلى 5 مرات 10 إلى الخلايا الأرومية الليمفاوية الخامسة ، أو خطوط الخلايا الأخرى ، في قارورة T25 مع 6 ملليلتر من وسط RPMI 1640 ، مكملة ب 1٪ Pen Strep ، و 2 مل أو أكثر من L-glutamine ، و 5٪ FBS. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. استخدم مقياس كثافة الدم ، أو عداد الخلايا الآلي ، لقياس كثافة الخلايا.

قبل أن تصل الخلايا إلى 1 في 10 إلى 6 خلايا لكل مليلتر ، قم بتدويرها عند 100 مرة G لمدة خمس دقائق ، وانقلها إلى قارورة T75 مع 25 مل من وسط RPMI 1640 الذي تم إعداده سابقا في هذا الفيديو. قم بتنمية الخلايا حتى تصل إلى كثافة خلية 1 في 10 إلى 6 خلايا لكل مليلتر ، ثم انقل الخلايا إلى قارورة T150 في 38 مل من نفس الوسط ، وقم بزراعتها لمدة يومين إضافيين. بعد ذلك ، قم بتدوير الخلايا عند 100 مرة G لمدة خمس دقائق ، وأعد تعليقها في 10 ملليلتر من وسط RPMI 1640.

ثم صب التعليق في زجاجة أسطوانية مساحتها 1850 سم مربع تحتوي على 500 مل من الوسط ، واحتضان الخلايا في نفس الظروف كما كان من قبل ، باستثناء الدوران المستمر. بمجرد الوصول إلى عدد الخلايا المطلوب ، قم بتدوير المزرعة عند 100 مرة G لمدة خمس دقائق ، وأعد تعليق الخلايا في 36 مل من وسط RPMI 1640. ثم انقل معلق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر ، وقم بإزالة الحصص الصغيرة لعد الخلايا واستخراج الحمض النووي.

لربط الخلايا ، أضف 1 مليلتر من 37٪ فورمالديهايد للوصول إلى تركيز نهائي قدره 1٪ ثم احتضان الخلايا عند 10 إلى 30 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. قم بإخماد تفاعل الربط المتقاطع بإضافة 2 ملليلتر من محلول جلايسين 2.5 مولار للحصول على تركيز نهائي يبلغ 125 مللي مولار. ثم احتضان الخلايا بالتناوب لمدة خمس دقائق.

بعد تكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، استخدم 1X PBS المثلج لغسل الخلايا مرتين. استمر في تحلل الخلايا وتثبيتها ، أو أعد تعليق الحبيبات في 5 ملليلتر من المخزن المؤقت لتحلل الخلايا ، وقم بتجميد التعليق قطرة قطرة في النيتروجين السائل. ثم قم بتخزين العينات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

لإجراء التحلل والإزالة ، أعد تعليق الحبيبات في 20 مل من المخزن المؤقت لتحلل الخلايا. الطرد المركزي الخلايا عند 400 مرة G, في 4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 6 ملليلتر من محلول تحلل النوى باستخدام مثبطات البروتياز.

استعدادا للصوتنة ، قسم العينة بالتساوي إلى ستة إلى ثمانية أنابيب Microfuge. ضع العينات على الثلج أو رف بارد ، واستخدم جهاز صوتي مع طرف صغير لصوتنها بسعة 65٪ مع خمس رشقات نارية ثابتة مدتها 20 ثانية ، مما يسمح للتعليق بالتبريد لمدة 40 ثانية على الأقل بين النبضات. الطرد المركزي للخلايا عند 12 ، 000 مرة G ، و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد ، وتخلص من الكريات.

بعد تقدير الاسترداد الكلي باستخدام القياس الفلوري ، قم بتجميد العينات. بعد تحضير التهجين ومخازن الغسيل وفقا لبروتوكول النص ، استخدم 1،200 ميكرولتر من مخزن التهجين 1X لغسل 600 ميكرولتر من الخرز ثلاث مرات. ثم استخدم 1،200 ميكرولتر من مخزن التهجين 2X لتعليق الخرز.

في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 ملليلتر ، أضف 600 ميكرولتر من العينة ، و 120 ميكرولترا من الخرزات المغسولة المعلقة في مخزن مؤقت للتهجين 2X ، و 480 ميكرولتر من مخزن التهجين 2X. احتضان الأنابيب عند 31 درجة مئوية ، و 30 إلى 60 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. ثم ضع الأنابيب على مغناطيس ، حتى يتم تثبيت الخرزات ، ونقل العينات إلى أنابيب جديدة قبل التخلص من الخرز.

أعد تعليق قليل النوكليوتيدات الالتقاط إلى محلول عملي من 10 بيكومول لكل ميكرولتر ، وأضف 4 ميكرولتر من هذا المحلول إلى كل أنبوب. احتضان الأنابيب عند 42 درجة مئوية في 30 إلى 60 دورة في الدقيقة لمدة 40 دقيقة. أثناء الحضانة ، ضع الخرزات اللازمة جانبا ، واغسل الخرزات ثلاث مرات كما كان من قبل ، ولكن هذه المرة استخدم مخزن التهجين 1X لإعادة تعليقها.

أضف الخرزات المغسولة إلى الأنابيب ، واحتضن العينات عند 30 إلى 60 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. ضع الأنابيب على المغناطيس ، وقم بإزالة المادة الطافية بمجرد تثبيت الخرز. بعد غسل الخرزات ، قم بمسح العينة بإضافة 40 ميكرولترا من الماء الجزيئي ، واحتضان الأنابيب عند 94 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

ضع الأنابيب على المغناطيس ، وانتظر بضع دقائق حتى يزول المحلول ، ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد ، وتخلص من الخرز. قم بتخزين العينة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر ، أو انتقل إلى التحليل البروتيني وفقا لبروتوكول النص. لتقييم إنتاجية الالتقاط ، استخدم الماء من الدرجة الجزيئية لتخفيف حصة من الشطف ، من واحد إلى عشرة.

بعد استخراج الحمض النووي من حصة تم التقاطها في وقت سابق من الفيديو ، استخدم عينة الحمض النووي والماء من الدرجة الجزيئية لإعداد منحنى قياسي ، مع خمسة تخفيفات تسلسلية من واحد إلى عشرة. قم بإعداد مزيج qPCR الرئيسي مع إضافة البادئات والمجسات ، وتوزيع الكمية المناسبة في كل بئر من التفاعل. إلى كل بئر ، أضف 5 ميكرولترات من العينة المخففة أو المنحنى القياسي أو الماء من الدرجة الجزيئية لتكون بمثابة تحكم في القالب.

أغلق الطبق وقم بتدويره عند 100 مرة جم لمدة دقيقة واحدة. ثم قم بتشغيل العينات في نظام qPCR باستخدام المعلمات الموجودة في بروتوكول النص. أخيرا ، استخدم المنحنى القياسي لتقييم الغلة ، والالتقاط الخلط لتقييم خصوصية الالتقاط.

تظهر هنا لقطات التهجين باستخدام معايرة قليل النوكليوتيدات. يزداد عدد قليل النوكليوتيدات تدريجيا ، بينما يظل التركيز الكلي ثابتا. تساعد هذه التجربة في تحديد عدد قليل النوكليوتيدات المختلفة اللازمة للوصول إلى كفاءات التهجين المثلى.

كما أنه يكشف عن أي تفاعلات تهجين ضارة واضحة بين مجموعة معينة من قليل النوكليوتيدات ، وإذا كان هناك أي أوليغوس ذات خصوصية ضعيفة ، مما يؤدي إلى خلفية عالية. لن تكون نسبة كبيرة من الشظايا في الكروماتين المتداخل قابلة لالتقاط التهجين. إذا تم تشغيل التقاط التهجين بنجاح ، فإن تجربة التقاط لاحقة لنفس مادة الكروماتين ، باستخدام مجموعة مختلفة من قليل النوكليوتيدات الالتقاط ، ستؤدي إلى عوائد مماثلة كما هو الحال عند استخدام الكروماتين الجديد.

ومع ذلك ، في تجربة التقاط ثانية باستخدام oligos الأصلي وبقايا الكروماتين من التجربة الأولى ، سينخفض العائد بنسبة 90٪ تقريبا إذا تم التقاط معظم المواد القابلة للتهجين في التجربة الأولى. يوضح هذا الشكل التقاط التهجين للمناطق المستهدفة للكروموسومات المختلفة ، حيث تعمل كل منطقة كعنصر تحكم سلبي للآخر. يعمل التسلسل المخلوطة أيضا كعنصر تحكم سلبي حقيقي.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون يومين ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر اختبار قليل النوكليوتيدات الملتقطة أولا ، للتأكد من أن المنطقة المرغوبة قابلة لالتقاط التهجين. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل الترسيب المناعي للكروماتين ، للإجابة على أسئلة إضافية ، مثل المكان الآخر في الجينوم الذي ترتبط فيه البروتينات المتفاعلة مع الحمض النووي المحدد.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية أداء HyCCAPP من أجل إثراء المناطق الجينومية ذات الأهمية بغرض تحديد تفاعلات البروتين المحلي من جديد.