بروتوكولات النظام الإيكولوجي تلفيق (اكوفاب) لتشييد مختبر النظم الإيكولوجية تهدف إلى دراسة التفاعلات بين الميكروبات والنبات
أبريل 10, 2018
توضح هذه المقالة بروتوكولات مفصلة لتلفيق النظام الإيكولوجي للأجهزة (اكوفابس) التي تمكن من دراسة النباتات والتفاعلات بين الميكروبات والنبات في الظروف المختبرية شديد.
العام لهذا البروتوكول هو تحديد مناهج موحدة لبناء أنظمة إيكولوجية نموذجية مبسطة للنباتات ، تسمى EcoFABs ، والتي تمكن من إجراء تجارب معملية خاضعة للرقابة وتكرارا للتحقيق في تفاعلات ميكروبات النبات التي يمكن اختبارها بشكل أكبر في هذا المجال. يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة تفاعلات ميكروبات النبات داخل البيئات الخاضعة للرقابة ، مما يسمح لنا باكتساب رؤى ميكانيكية مفصلة حول وظائف المناطق الأحيائية الدقيقة للسماح لنا بتسخيرها للزراعة المستدامة. لقد ساعدنا في تصميم أول Eco-FAB ، الذي يستخدم مجموعة متنوعة من تقنيات الطباعة ثلاثية الأبعاد المتاحة وتعقيم غرف نمو النبات التي تتيح كلا من الصور عالية الدقة غير المشتتة والتحليل الكيميائي.
يعد جهاز Eco-FAB الذي تم تطويره هنا مناسبا تماما لتحليل تفاعلات ميكروبات النبات لأنه يشتمل على تحليل مورفولوجيا الجذر والتصوير الطيفي الكتلي. بعد بناء قوالب Eco-FAB ، باستخدام الطباعة ثلاثية الأبعاد وفقا لبروتوكول النص ، في حاوية يمكن التخلص منها سعة لتر واحد ، امزج 40 مل من قاعدة المطاط الصناعي السيلوكسان مع أحجام مختلفة من عامل المعالجة ، اعتمادا على التجربة. ضع الحاوية في حجرة مفرغة لمدة 30 دقيقة على الأقل لإزالة فقاعات الهواء من خليط المطاط الصناعي.
ثم قم بإزالة الخليط ، واسكبه في قالب بلاستيكي مطبوع ثلاثي الأبعاد المجمع. من أجل إنشاء طبقة PDMS موحدة ، يجب إزالة فقاعات الهواء بعناية. استخدم الهواء المضغوط لتفجير أي بقايا هواء بعد نقل الخليط إلى القالب.
احتفظ بالقالب على كتلة تسخين عند 85 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. اترك القالب يبرد لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، اسحب الملحق برفق من القالب ، واستخدم سكينا متعدد الاستخدامات لفصل PDMS ببطء عن إطار الصب.
اضغط على قاعدة القالب باستخدام PDMS لأعلى من إطار الصب. بعد ذلك ، استخدم سكينا أو أدوات أخرى لفصل طبقة PDMS برفق عن قاعدة القالب عند الحواف ، وتقشيرها ببطء عن سطح القالب. باستخدام إبرة غير حادة عيار 15 ، قم بإنشاء قناة مدخل على طبقات PDMS عن طريق عمل ثقوب 1.6 ملم في هذا الجزء.
ثم استخدم المقص لقص حواف طبقات PDMS. لربط طبقات PDMS بشكل دائم بشرائح المجهر ، استخدم الميثانول لشطف جانب الترابط لطبقة PDMS عند شريحة مجهر 7.6 × خمسة سنتيمترات ، ثم قم بتفجيرها بالهواء المضغوط أو مسدس نيتروجين فائق النقاء. ضع شريحة المجهر وطبقة PDMS في منظف البلازما بحيث تكون جوانب الترابط متجهة لأعلى.
أغلق الغرفة وصمام تنفيس الغاز. ثم قم بتشغيل المكنسة الكهربائية وضخ الغرفة لمدة دقيقة واحدة. قم بتشغيل طاقة مولد البلازما ، وقم بتبديل تردد الراديو ، أو مستوى التردد اللاسلكي ، إلى مرتفع لمدة دقيقة واحدة.
بعد ذلك ، قم بإيقاف تشغيل كل من مضخة التفريغ وطاقة البلازما ، وتنفيس الغرفة في الغلاف الجوي. أخرج شريحة المجهر وطبقة PDMS من غرفة البلازما ، واضغط بسرعة على جميع الحواف الأربعة لطبقة PDMS على الشريحة بضغط متساو. تأكد من أن المنطقة البيضاوية المركزية ، وهي غرفة الجذر ، لا تلمس الشريحة.
باستخدام ماء فائق النقاء ، اشطف أجهزة Eco-FAB. ضع جهازا واحدا من أجهزة Eco-FAB في حاوية Eco-FAB ، وأضف 70٪ من الإيثانول حتى يتم غمر الجهاز. بعد ذلك ، أغلق غطاء الحاوية ورجها برفق لترطيب جميع الأسطح بالداخل بالإيثانول ، مع التأكد من أن غرفة نمو الجذر لجهاز Eco-FAB مملوءة بالإيثانول ، مع عدد قليل جدا من فقاعات الهواء أو معدومة.
بعد احتضان الأجهزة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، اسكب الإيثانول بنسبة 70٪ واستبدله بالإيثانول بنسبة 100٪. ثم احتضان الأجهزة لمدة خمس دقائق. بعد الحضانة ، قم بتصريف الإيثانول ، واترك Eco-FAB المعقم في غطاء التدفق الصفحي لمدة 16 ساعة لتجفيفه تماما.
إذا كان ذلك متاحا ، فقم بتعقيم النظام عن طريق تشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية في غطاء المحرك لمدة ساعة واحدة. لإجراء تعقيم البذور وإنباتها ، انقع البذور في 70٪ من الإيثانول لمدة دقيقتين. ثم ، باستخدام ماصة ، قم بإزالة الإيثانول ، واستخدم الماء المعقم لشطف البذور ثلاث مرات.
بعد ذلك ، انقع البذور في محلول مبيض بنسبة 10٪ لمدة خمس دقائق. ثم قم بإزالة محلول التبييض ، واستخدم الماء المعقم لغسل البذور جيدا ثلاث مرات. بعد الغسيل ، أضف الماء المعقم إلى البذور ، واحتضن الأنبوب عند أربع درجات مئوية لمدة سبعة أيام.
وزعي البذور بالتساوي على 0.5 Murashige و Skoog ، أو MS medium ، مع 0.6٪ فيتاجيل. وباستخدام شريط micropore ، أغلق اللوحات. ثم قم بزراعة النباتات إلى طول جذر يبلغ حوالي خمسة ملليلتر.
لنقل الشتلات إلى Eco-FABs ، باستخدام حقنة معقمة أو ماصة دقيقة وماء معقم ، قم بغسل حجرة الجذر لجهاز Eco-FAB ثلاث مرات ، ثم املأ غرفة الجذر بوسط النمو محل الاهتمام ، مثل وسط 0.5 مللي ثانية. الآن ، أدخل شتلة واحدة بعناية في خزان النبات لجهاز Eco-FAB. من المهم أن يتم نقل الشتلات بعناية من اللوحة إلى Eco-FAB حتى لا تنكسر الجذور.
أضف ثلاثة ملليلتر من الماء المعقم إلى الحاوية ، وتجنب جهاز Eco-FAB. سيؤدي ذلك إلى زيادة الرطوبة وتقليل تبخر الوسط من غرفة الجذر. ثم أغلق الحاوية واستخدم شريطا دقيقا لإغلاق الغطاء.
ضع Eco-FAB في حاضنة نباتات ، أو استخدم نظام الإضاءة Eco-FAB في بيئة درجة حرارة مضبوطة مناسبة لنمو النبات المعني. ثم اضبط الغرفة على 24 درجة مئوية. أخيرا ، قم بإجراء التنميط المستقلب وقياس الطيف الكتلي ، وفقا لبروتوكول النص.
تظهر هذه الأرقام أن Aaabidopsis thaliana البالغ من العمر سبعة أيام ، و brachypodium distachyon ، و panicum virgatum تنمو في Eco-FABs. تم العثور على كل من dicot و monocotton ترقى إلى مراحل التكاثر في Eco-FAB. تمثل هذه الشتلات مجموعة من العضدية العضدية التي يبلغ عمرها 14 يوما والتي تنمو في وسط الزراعة المائية ، بالإضافة إلى الرمل والتربة المكملة بوسط الزراعة المائية والماء ، على التوالي.
تسمحطبقة الركيزة الرقيقة والصلبة وغرف نمو الجذور للضوء بالتغلغل من خلاله للتصوير المجهري لأنظمة الجذر. هنا ، تم نقل شتلة brachypodium distachyon إلى جهاز Eco-FAB ، وتم تسجيل هيكل الجذر بواسطة كاميرا داخل جهاز تصوير هلام biorad. أظهر القياس الكمي لمساحة الجذر الإجمالية على مدار ثلاثة أسابيع زيادة تدريجية في المرحلة المبكرة ، تليها اتجاه نمو خطي حتى النهاية.
في هذا الشكل ، تمت إضافة Eco-FAB الذي يحتوي على البكتيريا الجذرية المعززة لنمو النبات ، pseudomonas simiae ، WCS417 إلى أنظمة جذر النبات عند 10 إلى الخلايا السادسة لكل نبات. استعمرت ميكروبات WCS147 سطح أنظمة الجذر بأكملها مع تركيز الميكروبات حول مناطق أطراف الجذر. عندما ينمو الوسائط المنعشة ويجمع إفرازات الجذر من Eco-FABs ، من المهم أن تتذكر معالجة كل العمل في غطاء معقم لتجنب أي تلوث.
يمكن أيضا تصنيع أجهزة Eco-FAB باستخدام ختم مادي قابل للانعكاس إما باستخدام مشبك مطبوع ثلاثي الأبعاد أو عن طريق تغيير لزوجة PDMS. يتيح ذلك استخدام وسائط النمو الصلبة والتصوير الطيفي الكتلي المباشر. بعد تطوير Eco-FAB ، سيسمح هذا النظام للباحثين في جميع أنحاء العالم باستخدام هذه النظم البيئية النموذجية المختبرية لدراسة تفاعلات ميكروبات النبات باستخدام بيولوجيا الأنظمة وتقنيات التصوير.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيع نظام Eco-FAB ، بالإضافة إلى تطبيقاته الواسعة في دراسات النظام البيئي. نأمل أن يسمح تصميم Eco-FAB هذا للعلماء الآخرين بالوصول إلى أهدافهم العلمية المحددة. والأهم من ذلك ، نأمل أن يبني العلماء الآخرون على تصميم Eco-FAB هذا ويجعلونه أفضل ، ويشاركونه مع علماء آخرين ، حتى نتمكن كمجتمع من بناء هذه النظم البيئية المختبرية للسماح لنا بفهم تفاعلات ميكروبات النبات بشكل أفضل.
لا تنس أن العمل مع الميكروبات والأدوات الحادة يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، وأنه يجب دائما اتخاذ الاحتياطات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
نظرة عامة
تصف هذه المقالة البروتوكولات التفصيلية لبناء EcoFABs، التي تسهل دراسات تفاعلات النباتات والميكروبات في بيئات مختبرية خاضعة للرقابة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- تفاعلات النباتات والميكروبات
- تصنيع النظام البيئي المتحكم فيه
- تطوير بروتوكولات المختبر
الخلفية
- EcoFABs هي نماذج بيئية مبسطة مصممة لتجارب المختبر.
- تسمح بدراسات خاضعة للرقابة وتكرارية لتفاعلات النباتات والميكروبات.
- تهدف الطريقة إلى توفير رؤى ميكانيكية لوظائف الميكروبيوم.
- يعزز استخدام تقنيات الطباعة ثلاثية الأبعاد تصميم هذه الأجهزة.
هدف الدراسة
- لتحديد مناهج قياسية لبناء EcoFABs.
- للتحقيق في تفاعلات النباتات والميكروبات في بيئة خاضعة للرقابة.
- لتمكين المزيد من الاختبارات للنتائج في ظروف ميدانية.
الطرق المستخدمة
- بناء قوالب EcoFAB باستخدام الطباعة ثلاثية الأبعاد.
- إعداد وتعقيم غرف نمو النباتات.
- بروتوكولات تعقيم البذور والإنبات.
- تنميط التمثيل الغذائي وتحليل الطيف الكتلي للتحليل.
النتائج الرئيسية
- نمو ناجح لمختلف أنواع النباتات في EcoFABs.
- تحليل مفصل لشكل الجذور والتفاعلات.
- تبرهن على فائدة EcoFAB للتصوير عالي الدقة.
- رؤى حول دور الميكروبيومات في الزراعة المستدامة.
الاستنتاجات
- توفر EcoFABs منصة قوية لدراسة تفاعلات النباتات والميكروبات.
- يمكن تطبيق البروتوكولات المحددة على أنواع مختلفة من النباتات.
- يمكن أن تساهم النتائج في التقدم في الممارسات الزراعية المستدامة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
EcoFABs provide a standardized, reproducible platform for mechanistic studies of plant-microbe interactions under controlled laboratory conditions. This enables de-risking of target validation in agricultural biotechnology by clarifying functional roles of microbiomes in plant health and stress response. The system supports predictive confidence in lead identification for microbiome-based bioinputs through dynamic monitoring of root exudates, microbial localization, and plant growth phenotypes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by manipulating microbiome composition, including mutant strains, to assess causal effects on plant phenotypes.
- Operational Value: Supports functional target validation through controlled addition of plant growth promoting rhizobacteria such as Pseudomonas simiae WCS417 and quantification of colonization patterns.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking microbial interventions to measurable outputs like root morphology, exudate composition, and growth kinetics.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by enabling sterile, reproducible mounting of seedlings and controlled media exchange in flow-through devices.
- Quantitative Outputs: Generates standardized metrics including total root area over time, microbial localization via mass spectrometry imaging, and exudate profiling for compound screening.
- Platform Reuse: Designed for scalability across plant species (Arabidopsis, Brachypodium, Panicum) and growth media (hydroponic, sand, soil), supporting cross-project standardization.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models plant-soil-microbe interactions relevant to sustainable agriculture and bioenergy feedstock production.
- Translational Continuity: Bridges discovery through preclinical validation by allowing progression from sterile lab conditions to defined soil/sand systems with supplemental media.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on reproducible phenotypes under controlled stress or nutrient conditions prior to field testing.
Pipeline & Workflow Integration
EcoFABs integrate into the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to lead identification and preclinical validation, supporting iterative design-test cycles for microbiome-based agricultural solutions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling manipulation of microbiome composition and environmental variables while monitoring plant responses.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through sterile fabrication, controlled hydration, and sealed incubation systems that minimize evaporation and contamination.
- Analytics: Provides quantitative measurements including root morphology imaging, metabolite profiling, and mass spectrometry data to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by supporting validation in increasingly complex media (sand, soil) while maintaining controlled variables.
- Enterprise Reuse: Designed as a reusable platform rather than a single-use tool, with modular design allowing adaptation across labs and plant models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in plant-microbe interactions.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through detailed sterilization protocols, 3D-printed molds, and controlled environmental conditions.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early de-risking of microbiome-based leads before field trials.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantitative, reproducible phenotypes linked to microbial interventions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile technique, 3D printing, and PDMS handling for device fabrication.
- Depends on access to plasma cleaners, vacuum chambers, and imaging systems for bonding and analysis.
- Necessitates cross-team standardization of protocols for seed transfer, media exchange, and contamination control.
- Requires adaptation considerations when switching between liquid, sand, or soil-based growth media while maintaining sterility.
- Limited by the need for aseptic workflows during exudate sampling and media refresh to prevent biofilm formation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:13
EcoFAB Device Fabrication: Casting PDMS Layers
3:22
EcoFAB Device Fabrication: Chemically Attached PDMS Layers onto Microscope Slides
4:50
EcoFAB Sterilization
5:59
Growing Plants in EcoFABs
8:31
Results: Plant-microbe Interactions Using Ecosystem Fabrication Protocols
10:18
Conclusion
