تشكيل التساهمية الحمض النووي Adducts بالمواد المسرطنة انزيماتيكالي المنشط والمخدرات في المختبر وتصميمها من ³²فبوستلابيلينج

الهدف العام من هذا البروتوكول هو وصف الطرق التي تستخدم التفاعلات المحفزة بواسطة السيتوكروم p450 وإنزيمات التحول الأحيائي الإضافية للتحقيق في فاعلية المواد الكيميائية أو الأدوية لتنشيطها إلى المستقلبات التي تشكل مقاربات الحمض النووي التساهمي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تطور السرطان وعلاجه. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تظهر لك نوعا من الطرق لتقييم فاعلية المواد الكيميائية البيئية أو الأدوية لتشكيل مقاربات الحمض النووي التساهمية التي تمثل بدء تطور السرطان.

الآثار المترتبة على هذه التقنية التي تحدد فاعلية المواد الكيميائية المسببة للسرطان. الفاعلية البيئية والمواد السامة والأدوية وتحدد أيضا طرقا بسيطة نسبيا لتكوين مقاربات الحمض النووي التساهمية التي تتكون من هذه المركبات. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لبدء تطور السرطان وعلاجه ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا في مجالات علمية أخرى.

مثل دراسات الآليات الجزيئية ، وتلف الحمض النووي ، والدراسات الشفوية حول التنشيط الأنزيمي وتسميم المواد الكيميائية. سمعت فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما قمت بالتحقيق في العمليات التي تنطوي عليها مرحلة بدء التسرطن الكيميائي. قم أولا بإعداد خليط الحضانة عن طريق إضافة جميع المركبات وأنظمة الإنزيم إلى حجم نهائي قدره 0.75 مليلتر عند أربع درجات مئوية.

هذا لاحتضان المادة المسرطنة مع الحمض النووي في وجود السيتوكروم p450. ثم أضف الميكروسومات أو p450 المؤتلف النقي إلى الخليط. بعد ذلك ، أضف 7.5 ميكرولتر من عقار بيضاوي الشكل 0.1 ملليمولار المذاب في DMSO و 42.5 ميكرولتر من الماء لضبط الحجم النهائي إلى 0.75 ملليلتر.

ثم امزج المكونات عن طريق دوامة الأنبوب لمدة خمس ثوان. بعد ذلك مباشرة ، احتضن الأنبوب عند 37 درجة مئوية مع فتح الغطاء لمدة 30 إلى 60 دقيقة. بعد ذلك ، اخلطي الفينول أو كلوروفورم الفينول بنسبة واحد إلى واحد مع خليط الحضانة في أنبوب إيبندورف.

سيؤدي ذلك إلى إزالة تلوث البروتين من الحمض النووي في خليط الحضانة. ثم حرك الخليط لتشكيل مستحلب. ثم قم بتدوير الخليط على حرارة 1600 مرة لمدة ثلاث دقائق في درجة الحرارة المحيطة.

بمجرد انتهاء الطرد المركزي ، استخدم ماصة لنقل مرحلة الماء العلوية إلى أنبوب بولي بروبلين جديد. ثم تخلص من واجهة البروتين مع المرحلة العضوية. بعد ذلك ، امزج مرحلة الماء بحجم مكافئ من الفينول والكلوروفورم بنسبة واحدة إلى واحدة.

ثم كرر الطرد المركزي. بعد ذلك ، أضف كميات متساوية من الكلوروفورم إلى مرحلة الماء التي تم جمعها وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى. ثم قم بترسيب الحمض النووي من المرحلة المائية عن طريق إضافة مجلدين من الإيثانول البارد المحفوظ عند 20 درجة مئوية تحت الصفر.

ثم اخلطي المحلول جيدا. للتحضير لوضع العلامات على مقاربات الحمض النووي ، امزج محلول البيسين العازل مع محلول ATP الموسوم بالإشعاع لتسمية مقاربات الحمض النووي. أضف خليط الملصقات إلى محلول NP1 ، أو مزيج تخصيب البيوتانول.

دع الخليط يقف في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. ثم ضع ما يقرب من 20 ميكرولترا على العينة بأكملها على لوحة TLC السليلوز PEI. بعد اكتشاف العينة على لوحة TLC PEI-cellulose TLC ، اترك اللوحة لتتطور في اتجاه D1 لتنظيف المقارب.

بمجرد أن تجف اللوحة ، اترك اللوحة تتطور في اتجاهين D3 و D4. للتطوير في D3 ، استخدم المخزن المؤقت لفورمات الليثيوم عند درجة الحموضة 3.5 مع اليوريا. لتطوير D4 ، استخدم المخزن المؤقت Tris-HCl مع كلوريد الليثيوم واليوريا.

من أجل تجنب أي مشاكل للتطوير في اتجاه D4 ، قم بتطوير الألواح في اتجاه D5 أيضا. أولا ، يتم استخدام تقنية P32-postlabeling لدراسة كفاءة الميكروسومال p450 الميكروسومي المنشط بيولوجيا في تكوين مقاربات الحمض النووي. تظهر النتائج تكوين مقاربات الحمض النووي التساهمية في ديوكسيجوانوزين الحمض النووي الغدة الصعترية في العجل في وجود كل من الفئران و / أو الميكروسومات الكبدية البشرية. ومع ذلك ، لا يتم تشكيل مقاربات في المجموعة الضابطة.

بعد ذلك ، تتم دراسة إمكانات الإهليلجيين المنشط المعتمد على إنزيم البيروكسيداز. تظهر الصورة تكوين مقاربات الحمض النووي التساهمية في الحمض النووي للغدة الصعترية في العجل في وجود بيروكسيداز الفجل الحار ، واللاكتوبيروكسيداز البقري ، والنخاع المايلوبيروكسيداز البشري. في الواقع ، تتشكل مقاربات الحمض النووي أيضا من الحمض النووي للكبد عندما يتم التعامل مع الفئران ب 40 ملليغرام لكل كيلوغرام من وزن الجسم الإهليلجي في الجسم الحي.

ومن المثير للاهتمام ، أن إنزيم السيتوكروم البشري p450 CYP3A4 يظهر أيضا إمكانات قوية لأكسدة القطع الناقص بكفاءة إلى مستقلبات مثل 12-hydroxyellipticine و 13-hydroxyellipticine. يمكن أن ترتبط هذه المستقلبات بسهولة بالحمض النووي لتشكيل المقاربات. بعد ذلك ، يتم استخدام طرق تخصيب النوكلياز P1 و n-butanol لدراسة تكوين مقاربات الحمض النووي عند تنشيط 3-nitrobenzanthrone مع اختزال العصارة الخلوية مثل NQ01 من الفئران والإنسان.

تظهر النتائج تكوين ما يصل إلى خمسة مقاربات من الحمض النووي من الحمض النووي للغدة الصعترية في ربلة الساق تم الحصول عليها من الفئران ، والعزلة الخلوية الكبدية البشرية ، وكذلك كبد الفئران. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون يومين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. من خلال محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استقرار الأنظمة الأنزيمية المستخدمة.

قد يتضاءل نشاط الإنزيم إذا لم يتم تخزينه على الجليد. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الكيمياء الحيوية ، والكيمياء الحيوية للتسرطن الكيميائي لاستكشاف طبيعة الظاهرة من عمليات بدء تطور السرطان في الكائنات الحية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقييم فاعلية المواد الكيميائية البيئية أو الأدوية المراد تنشيطها إنزيميا لاستقلاب مقاربات الحمض النووي التساهمية الوراثية.

تمثل هذه العملية أهمية كبيرة لتطوير العلاجات القائمة على السرطان. لا تنس أنك تعمل بمواد كيميائية يمكن أن تكون خطيرة للغاية. المواد المسرطنة المحتملة والمواد الكيميائية المشعة ، على سبيل المثال الفوسفور ATP.

لذلك ، يجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل قفازات اللاتكس المختبرية وألواح زجاج شبكي أثناء تنفيذ هذا الإجراء.