سريع الفضة تلطيخ البروتوكول تمكين بسيطة والكشف عن كفاءة من علامات الاشتراكية السوفياتية باستخدام هلام Polyacrylamide يشوه عدم

الهدف العام لهذا البروتوكول هو تقديم طريقة محسنة لتلوين الفضة للكشف السريع والسهل والمنخفض التكلفة لعلامات SSR في المواد الهلامية غير المتمسخة بمادة البولي أكريلاميد. يمكن أن يساعد التنميط الجيني السريع لعلامات SSR في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البحث الجيني والتطبيق مثل تحليل التنوع الجيني والاختيار بمساعدة العلامات في برامج التربية الجزيئية. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها سهلة التنفيذ ، وتستغرق وقتا أقل وتستخدم كواشف كيميائية أقل من البروتوكولات الأخرى للكشف عن علامات SSR.

تتجنب هذه الطريقة التثبيت والإيقاف والعديد من خطوات الغسيل الموجودة في البروتوكولات التقليدية. ولا يتطلب سوى الخطوتين الرئيسيتين للتشريب والتطوير. يمكن إنتاج صور واضحة باستخدام هذا البروتوكول حيث لا توجد ضوضاء في الخلفية للكشف الواضح عن أنماط نطاقات SSR.

يمكن للمرء فحص ما يقرب من 800 عينة من الحمض النووي يوميا باستخدام هذه التقنية وقد تم استخدامها بنجاح في أبحاث التبغ والملفوف الصيني المزهر. بعد تحضير منتجات PCR ومحاليل الجل وفقا لبروتوكول النص ، استخدم المنظف في ماء الصنبور لغسل مجموعة واحدة من الألواح الزجاجية والفواصل متبوعة بشطف كامل بالماء المقطر. ضع الألواح في رف تجفيف الألواح حتى تجف في الهواء.

قم بتفريق ملليلتر واحد من محلول Bind-silane على السطح الداخلي لصفيحة زجاجية مستطيلة وجففها لمدة خمس دقائق. ثم قم بتفريق ملليلتر واحد من Repel-silane على السطح الداخلي لصفيحة زجاجية مسننة بمسحة ، واستخدم مناديل ورقية لمسح المحلول الزائد قبل السماح للوحة بالجفاف في الهواء لمدة خمس دقائق. قم بتجميع الألواح الزجاجية بفواصل مع وجود اللوحة المسننة في الأعلى.

واستخدم مشابك الصب لتثبيت جانبي التجميع. بعد ذلك ، صب كمية مناسبة من محلول هلام بولي أكريلاميد غير متغير للطبيعة بنسبة 6٪ في دورق لمجموعة اللوحة. أضف 20 ميكرولترا من TEMED و 200 ميكرولتر من 20٪ APS الطازج واخلطه برفق.

صب المحلول على الفور وبعناية في الألواح الزجاجية المجمعة على طول حافة اللوحة المسننة ، وملء الفراغ تقريبا إلى الأعلى. وأدخل المشط. ثم أضف كمية صغيرة من محلول الجل فوق المشط واترك الجل يتماسك في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

عندما يتم بلمرة الجل بالكامل ، قم بإزالة مشابك الصب وضع اللوحة الموضوعة في وحدة خزان الرحلان الكهربائي مع توجيه اللوحة المسننة نحو الخزان العازل العلوي. استخدم مشابك كبيرة لتوصيل مجموعة اللوحة بوحدة الخزان. صب لتر واحد من 0.5 × TBE عازلة في كل غرفة من الغرف العلوية والسفلية.

ثم قم بإزالة المشط واستخدم ماصة أو حقنة مملوءة بالمخزن المؤقت لشطف جميع الآبار تماما. لتشغيل هلام بولي أكريلاميد ، قم بتحميل حوالي ميكرولتر واحد من منتج PCR في كل بئر. أيضا ، قم بتحميل سلم الحمض النووي على كلا الطرفين.

ثم قم بتثبيت غطاء الأمان في الغرفة العازلة العلوية. قم بتوصيل الخيوط بمصدر الطاقة ، ومطابقة اللون المشفر بالأحمر بالأحمر ، والأسود بالأسود. قم بتشغيل الجل بجهد ثابت 110 فولت حتى تصل الصبغة إلى موضع محدد.

عادة ، لمدة 70 دقيقة تقريبا. بعد الرحلان الكهربائي ، افتح الصمام واستنزف المخزن المؤقت من الغرفة العلوية إلى دورق كبير. افصل المشابك الجانبية وقم بإزالة اللوحة من الجهاز.

ثم استخدم ملعقة لفصل اللوح الزجاجي المحزز بعناية على جانب واحد وتأكد من بقاء الجل متصلا باللوحة الزجاجية الأخرى المطلية ب Bind-silane. بعد ذلك ، قم بإعداد لتر واحد من محلول التشريب الطازج عن طريق إذابة 1.5 جرام من نترات الفضة في لتر واحد من الماء المقطر. ثم قم بإعداد لتر واحد من محلول التطوير الطازج عن طريق إذابة 10 جرامات من هيدروكسيد الصوديوم في 900 مل من الماء المقطر.

أضف ملليلترا واحدا من 37٪ فورمالديهايد واستخدم الماء المقطر للتكيف مع الحجم النهائي البالغ لتر واحد. باستخدام كمية وفيرة من الماء المقطر ، اشطف الجل واللوح الزجاجي بعناية لإزالة المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي. ثم ضع الطبق بحيث يكون الجل متجها لأعلى في صينية بلاستيكية واغمر الجل في لتر واحد من محلول التشريب.

رج الدرج برفق على شاكر بسرعة 60 دورة في الدقيقة لمدة ثلاث إلى أربع دقائق. انقل اللوحة من محلول التشريب إلى صينية أخرى. ثم استخدم كمية وفيرة من الماء المقطر لشطف محلول التشريب المتبقي من سطح اللوحة والهلام مرتين لمدة ثلاث إلى خمس ثوان لكل منهما.

خطوة غسل الجل بعد التشريب أمر بالغ الأهمية. غسل غير كاف بلدي إزالة غير كاملة من محلول التشريب. وينتج عنه خلفية داكنة.

ضع المكان مع توجيه الجل لأعلى في صينية أخرى. اغمر اللوحة في لتر واحد من محلول التطوير ثم رج الدرج برفق عند 50 دورة في الدقيقة لمدة ثلاث دقائق تقريبا. راقب ظهور شظايا الحمض النووي وتوقف عن التطور عند ملاحظة أعلى نسبة لإشارة شظايا الحمض النووي إلى ضوضاء الخلفية.

وقت التطوير المناسب هو خطوة رئيسية أخرى. يمكن أن يؤدي التطوير المفرط إلى خلفية بنية داكنة مع صورة منخفضة التباين لشظايا الحمض النووي. اشطف الطبق والجل بالماء المقطر الوفير مرتين واستخدم المناديل الورقية لتجفيف لوحة الجل.

ثم استخدم ماسحا ضوئيا والبرنامج المناسب لمسح الجل بدقة 300 نقطة في البوصة وضبط السطوع والتباين للحصول على تصور واضح لنطاقات الحمض النووي. أخيرا ، قم بتسجيل نمط النطاقات لعلامات SSR بناء على أحجام أجزاء الحمض النووي في الصورة. تم إنتاج أمبليكونات تفاعل البوليميراز المتسلسل المعروضة هنا باستخدام أزواج التمهيدي SSR المقابلة في الملفوف الصيني المزهر والتبغ.

بعد الرحلان الكهربائي ، تم تلطيخ المواد الهلامية بولي أكريلاميد باستخدام بروتوكول تلطيخ الفضة الموضح في هذا الفيديو. والتي اكتشفت بشكل لا لبس فيه أنماط النطاقات لعلامات SSR. لمقارنة كفاءة الكشف عن بروتوكولات تلطيخ الفضة المختلفة ، تم فصل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل لعلامات SSR باستخدام PAGE ، وتم تصورها باستخدام خمسة بروتوكولات تلطيخ فضة منشورة وطريقة سادسة موضحة في هذا الفيديو.

يحتوي البروتوكول المعروض هنا على أقل ضوضاء في الخلفية وأعلى تباين لشظايا الحمض النووي بحيث أنتج أعلى وضوح للصورة. من بين البروتوكولات الستة التي تم اختبارها ، تستغرق الطريقة الموضحة هنا أقل قدر من الوقت وتتطلب أقل عدد من الكواشف الكيميائية وخطوات العملية. أخيرا ، يوضح هذا الشكل حساسية البروتوكول كما تم قياسه باستخدام تخفيف تسلسلي لعلامة DNA من 50 إلى 2000 نقطة أساس على هلام بولي أكريلاميد غير متغير الطبيعة من 10 نانوجرام لكل نطاق في الممر الأول إلى 9.8 بيكوجرام لكل نطاق من الحمض النووي في الممر 11.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في سبع دقائق إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر منع التلوث المتبادل لحلول التشريب والتطوير. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين للتنميط الجيني بسرعة علامات SSR.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اكتشاف علامات SSR ببساطة وكفاءة في هلام بولي أكريلاميد غير متغير الطبيعة باستخدام تلطيخ الفضة. لا تنس أن العمل مع الكواشف الكيميائية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما ارتداء الاحتياطات مثل القفازات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.