التحديد الكمي للبروتين خاصة بالموقع يسين Acetylation و Succinylation Stoichiometry الكتلي حيازة مستقلة عن البيانات باستخدام
أبريل 4, 2018
هنا، فإننا نقدم القياس الكمي غير منحازة للبروتين خاصة بالموقع شغل أسيتيليشن و/أو سوكسينيليشن (ستويتشيوميتري) للبروتين الكامل عن طريق تحليل راتيوميتريك الذاتية تعديلات على التعديلات التي أدخلت بعد الكمية أسيليشن الكيميائية استخدام مستقرة أو أملاحه المسماة النظائر. في تركيبة مع حيازة مستقلة عن البيانات الحساسة الكتلي، يتم الحصول على قياسات شغل الموقع دقيقة.
الهدف العام من سير العمل الجديد هذا هو تحديد الإشغال أو القياس المتكافئ لتعديلات البروتين بعد الترجمة في مواقع أستلة محددة. يوفر سير العمل الطيفي الكتلي الجديد هذا مستوى أعلى من دقة القياس الكمي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول تنظيم البروتين القابل للانعكاس عن طريق التعديل اللاحق للترجمة مثل أستلة اللايسين أو مواقع السكسينيلية الأكثر تعديلا وقد تغير وظيفة البروتين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن القياس المتكافئ على مستوى الموقع لأتليه اللايسين والسكسينيلية والسكسينيلية يتم تحديدها بدقة ويمكن للطريقة تحديد القياس المتكافئ من الببتيدات التي تحتوي على بقايا متعددة من اللايسين. هذه التقنية وثيقة الصلة لأنها تكشف عن القياس المتكافئ للأستلة والسكسينيلاسیون أو النسبة المعدلة مقابل غير المعدلة بدلا من قياس تغير الوفرة النسبية بلا أبعاد. خطرت لي فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما أدركت أن استخدام عمليات الاستحواذ المستقلة على البيانات والقياس الكمي المستند إلى MS2 لتحليل القياس المتكافئ من شأنه أن يحسن بشكل كبير دقة القياس. إعداد ثلاث نسخ مكررة من 100
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة سير عمل جديداً باستخدام مطياف الكتلة لتقدير كمية تعديلات ما بعد الترجمة للبروتينات، وبالتحديد الأسيتيلة والسكسينيلة. تعمل هذه الطريقة على تعزيز دقة القياس من خلال تحديد نسبة الإشغال أو القياس المتكافئ لهذه التعديلات في مواقع محددة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- الكيمياء الحيوية
- مطيافية الكتلة
- البروتيوميات
خلفية علمية
- تلعب تعديلات ما بعد الترجمة دوراً حاسماً في وظيفة البروتين.
- يعد فهم عمليات الأستلة والسكسنيلة أمراً حيوياً لدراسة التنظيم العكسي للبروتينات.
- قد تفتقر الطرق التقليدية إلى الدقة في قياس هذه التعديلات كمياً.
- تهدف هذه الدراسة إلى تحسين دقة قياسات التكافؤ الكيميائي (stoichiometry).
الغرض من الدراسة
- تطوير سير عمل للتقدير الكمي الدقيق لعمليتي أسيتلة وسكسنيلة البروتين.
- تحديد مواقع الليسين الأكثر تعرضاً للتعديل وتأثير ذلك على وظيفة البروتين.
- توفير طريقة يمكنها تحليل الببتيدات التي تحتوي على بقايا متعددة من الليسين.
الطرق المستخدمة
- التحليل النسبي للتعديلات الداخلية.
- الأسيلة الكيميائية الكمية باستخدام أنهيدريدات مُعلمة بنظائر مستقرة.
- قياس الطيف الكتلي بالاستحواذ المستقل عن البيانات.
- تحضير مكررات متعددة لضمان الدقة.
النتائج الرئيسية
- تسمح هذه الطريقة بالتحديد الدقيق للنسب القياسية (stoichiometry) على مستوى الموقع.
- تكشف عن نسبة بقايا اللايسين المعدلة مقابل غير المعدلة.
- دقة قياس أعلى مقارنة بالطرق التقليدية.
- تحدد مواقع الأسيتلة والسكسنيلة الرئيسية التي تؤثر على وظيفة البروتين.
الاستنتاجات
- يعزز سير العمل هذا بشكل كبير من قياس كمية تعديلات البروتين.
- يوفر رؤى حول تنظيم وظيفة البروتين من خلال عمليات الأستلة والسكيسنيلية.
- تعتبر هذه التقنية قابلة للتطبيق في مجموعة واسعة من الدراسات البروتومية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في القطاع الصناعي
يتيح التحديد الكمي الدقيق لنسب تكرار عملية أسيتلة وسكسنيلة الليسين في مواقع محددة تقييماً دقيقاً لمدى إشغال التعديلات ما بعد الترجمية، وهو أمر بالغ الأهمية لفهم التنظيم البروتيني العكسي في مسارات الأهداف الدوائية. توفر هذه الطريقة قياساً غير منحاز لمستويات التعديل على نطاق البروتوم بأكمله، مما يدعم التحقق من صحة الأهداف من خلال التمييز بين مواقع الأسيلة ذات الصلة بيولوجياً والضجيج الخلفي. ومن خلال تقديم بيانات قياس اتحادية بدلاً من التغيرات في الوفرة النسبية، فإنها تعزز الثقة التنبؤية في تقليل المخاطر الآلية خلال مراحل الاكتشاف المبكرة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال قياس مدى إشغال عمليات الأستلة والسكسنيلة في بقايا ليسين محددة.
- القيمة التشغيلية: تدعم الحد من المخاطر البيولوجية من خلال القياس الدقيق لقياس اتحادية التعديل (stoichiometry)، مما يوضح التأثير الوظيفي على نشاط البروتين.
- القيمة التنبؤية: تعزز الثقة في الهدف من خلال تحديد المواقع المعدلة الأكثر احتمالية لتغيير الوظيفة، مما يساعد في عملية فرز وتحديد أولويات محفظة المشاريع.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: يعمل على تحضير الأنظمة البيولوجية المعتمدة لسير العمل اللاحق من خلال توفير بيانات إشغال الأسيلة على مستوى الموقع.
- المخرجات الكمية: يستخدم مساحات ذروة أيونات الشظايا من DIA-MS لتمكين القياس الكمي الدقيق والمخفض من التداخل، بما يتناسب مع توحيد معايير المقايسة.
- القابلية للتوسع: يسهل الجاهزية للفحص من خلال تحليل بروتيني قابل للتكرار ومتعدد الإرسال لعمليات الأسيتيلة والسكسينيلة.
الأبحاث التحويلية وقبل السريرية
- الاستمرارية الانتقالية: تربط بين توصيف التعديلات في مرحلة الاكتشاف والتحقق قبل السريري من خلال تحديد مواقع الأسيلة ذات الصلة بالمرض.
- تقليل المخاطر الميكانيكية: تركز على القيمة التنبؤية عن طريق تحديد قياس اتحادية العناصر (stoichiometry) من الببتيدات التي تحتوي على بقايا ليسين متعددة، مما يسمح بالتمييز الدقيق للمواقع.
- التقدم المعدل حسب المخاطر: تدعم قرارات الاستمرار أو التوقف من خلال الكشف عن تعديلات الليسين ذات الأهمية الوظيفية مقابل تلك التي تحدث بشكل عشوائي.
تكامل مسارات العمل والتدفقات الإجرائية
تتكامل هذه الطريقة ضمن تسلسل عملية الاكتشاف، بدءاً من التحقق المبكر من الهدف وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة، حيث توفر بيانات قياسية عن عمليات الأستلة والسكسنيلة، مما يساهم في تعزيز الفهم الميكانيكي وتأثيرات المركبات على وظيفة البروتين.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات من خلال تحديد كمية إشغال التعديل في مواقع محددة استجابةً للاضطرابات.
- الفحص: تتيح جاهزية المقايسة من خلال القياس الكمي الموحد لمستويات التعديل عبر العينات البروتومية.
- التحليلات: توفر قياسات دقيقة للنسب الكمية (stoichiometry) عبر تحديد كمية أيونات الشظايا في تقنية DIA-MS، مما يسمح بمقارنة دقيقة لحالات التعديل.
- الأبحاث الانتقالية: تربط بالاستمرارية قبل السريرية من خلال تحديد مواقع الأسيلة ذات الإشغال العالي التي قد تعمل كعلامات حيوية أو مؤشرات ميكانيكية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تعمل كقدرة بروتومية قابلة لإعادة الاستخدام لإجراء توصيف متسق لتعديلات ما بعد الترجمة (PTM) عبر المشاريع وفئات الأهداف المختلفة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: توفر ثقة تنبؤية من خلال قياس دقيق لنسب العناصر المتكافئة (stoichiometry) لعمليات الأستلة والسكسينيلة على مستوى الموقع، مما يقلل من الغموض الميكانيكي في التحقق من الأهداف.
- القيمة التشغيلية: تضمن التقييس وقابلية التكرار عبر استخدام DIA-MS والتقدير الكمي القائم على Skyline، مما يقلل من التباين التقني.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال تحديد مواقع التعديل ذات الإشغال العالي والأهمية الوظيفية، مما يقلل من المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة.
- التأثير على المحفظة: تتيح تحديد أولويات الأهداف بناءً على الأدلة الوظيفية المدفوعة بالتعديلات مع مراعاة المخاطر.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في البروتيوميات القائمة على مطيافية الكتلة وتقنيات إثراء تعديلات ما بعد الترجمة (PTM).
- الاعتماد على أجهزة تدعم تحليل الاستحواذ المستقل عن البيانات (DIA) وإنشاء مكتبة طيفية لضمان القياس الكمي الدقيق لأيونات الشظايا.
- يستلزم توحيد معايير تحضير العينات وبروتوكولات الأسيلة الكيميائية بين الفرق لضمان إمكانية تكرار النتائج.
- يتضمن اعتبارات التكييف عند تطبيق سير العمل على أنظمة نماذج أو أنواع أنسجة متنوعة.
- يتضمن قيوداً عملية تتعلق بمدى إمكانية اكتشاف الببتيدات وإمكانية الوصول إلى بقايا اللايسين في المخاليط المعقدة.
الأسئلة الشائعة حول الأدوية الحيوية
Chapters in this video
0:04
Title
1:18
Quantitatively Acetylate and/or Succinylate Proteins Using Isotope-labeled Acetic or Succinic Anhydride
3:48
Digest Reacted Protein Samples Using Glu-C Endoproteinase
6:27
Fractionate Peptides Using Offline Basic-pH Reversed Phase HPLC
8:15
Example Data Analysis Tutorial
10:28
Results: Succinylation Stoichiometry Ratio Calculation of Pre-succinylated BSA
11:13
Conclusion
