تحديد خلايا الهيكل العظمى والعضلات الأقمار الصناعية قبل الفلورة مع Pax7 والأجسام المضادة لامينين

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تحديد الخلايا الساتلية لعضلات الهيكل العظمي البالغة عبر التألق المناعي. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بعدد وتوزيع الخلايا الجذعية العضلية في كل من الحالات الفسيولوجية والمرضية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن للمرء تحديد الخلايا الجذعية العضلية في بيئتها الفسيولوجية مع معالجة محدودة فقط.

ستظهر الإجراء فايزة ناز ، باحثة ما بعد الدكتوراه من مختبري. للبدء ، قم بإعداد حمام نيتروجين سائل عن طريق صب النيتروجين السائل في قارورة ديوار. بعد ذلك ، صب 10 مل من ميثيل البيوتان في دورق بلاستيكي سعة 20 مليلتر وانقل الدورق إلى حمام النيتروجين السائل.

ضع العضلات الأمامية للظنبوب التشريح على السطح المسطح لمكبس حقنة بلاستيكية صغيرة. بعد ذلك ، قم بتغطية العضلة المقطعة ببضع قطرات من مركب درجة حرارة القطع المثلى أو OCT ، قم بإزالة دورق ميثيل بوتان من حمام النيتروجين السائل ، ثم قم بإذابة السطح باستخدام مقابض زوج من المقص. اغمس الأنسجة المغطاة ب O.C.T بسرعة في ميثيل البيوتان المذاب لتجميدها.

بعد ذلك ، استخدم الملقط لفصل الأنسجة المضمنة عن المكبس ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. ثم قم بتخزين أنبوب الطرد المركزي الدقيق في النيتروجين السائل. لبدء تقسيم ناظم البرد ، أضف قطرة من مركب O.C.T. على مركز حامل عينة ناظم البرد واتركه يتجمد جزئيا.

بعد ذلك ، قم بلصق الأنسجة المضمنة في مركب OCT مع جانب الكاحل لأسفل وجانب الركبة لأعلى. بعد ذلك ، قم بتركيب حامل العينة على ناظم البرد وقم بقطع الأنسجة على فترات 10 ميكرومتر. اجمع أربعة إلى ثمانية عمليات مقطعة بالتبريد على كل شريحة مغطاة بالصقيع.

جفف الأقسام في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث ساعات ، ثم اجمع الشرائح في صندوق منزلق وقم بتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. بعد ذلك ، قم بإزالة شريحة من صندوق الشرائح وقم بتسخينها إلى درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، استخدم قلم مانع السوائل لتحديد منطقة حول عمليات القطع بالتبريد لمنع السوائل من التدفق من الجانب.

في غطاء الدخان ، أضف 300 إلى 500 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهايد إلى المنطقة المحددة. احتضان الشريحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق لإصلاح الأقسام. بعد ذلك ، اشطف بارافورمالدهيد من الشريحة باستخدام PBS في حاوية شريحة.

لبدء استرجاع المستضد ، املأ حاوية منزلقة ب 200 مل من عازلة السترات وانقل الشريحة إلى الحاوية. ثم انقل الحاوية المنزلقة إلى قدر الضغط عند ضغط عال لمدة 10 دقائق. تكون خطوة استرجاع المستضد اختيارية إذا تم تجفيف الأقسام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة والمتابعة على الفور.

ثم خطوة استرجاع المستضد ليست ضرورية. ولكن إذا تم تجفيف الأقسام في درجة حرارة الغرفة لأكثر من ثلاث ساعات ثم تخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر ، فإن خطوة استرجاع المستضد مطلوبة. بعد ذلك ، قم بتبريد حاوية الشريحة تحت الماء الجاري لمدة 10 دقائق.

ثم انقل الشريحة إلى وعاء جديد به 200 مل من PBST واشطفها باستخدام PBST. أضف مناديل المختبر المبللة بالماء إلى الدرج ، ثم ضع علامة على الشريحة المغسولة بقلم عنق الرحم وضعها في الدرج. أضف 200 ميكرولتر من محلول الحظر إلى الشريحة.

ثم غطي الصينية واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. خطوة الحظر مهمة جدا لأن الجسم المضاد Pax7 المستخدم هو جسم مضاد أحادي النسيل للفأر. تقلل خطوة حظر الماوس على الماوس من الروابط غير المحددة.

بعد ذلك ، اشطف الشريحة باستخدام PBST في حاوية الشريحة وأعدها إلى الدرج. أضف 200 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة الأولية إلى الشريحة واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، اشطف الشريحة باستخدام PBST ، ثم أضف 200 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة الثانوية واحتضانها في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

بعد فترة الحضانة ، اشطف الشريحة باستخدام PBST. خفف DAPI في حاوية منزلقة واحتضان الشريحة في الحاوية لمدة ثلاث دقائق. ثم اشطف DAPI باستخدام PBST لمدة خمس دقائق.

أخيرا ، قم بتركيب الشريحة بوسائط التثبيت وقم بتطبيق غطاء. في هذه الدراسة ، تم تصور الخلايا الساتلية بنجاح في أقسام العضلات البالغة تحت المجهر الفلوري. يتم تقليل ضوضاء الخلفية التي تظهر عادة مع الأنسجة العضلية البالغة وأنواع معينة من الألياف باستخدام حجب الماوس على الفأر.

يتم تعزيز إشارات البقع المناعية المحددة باستخدام الأجسام المضادة الثانوية المقترنة بأصباغ Alexa الساطعة. يلتقط المجهر متحد البؤر ثنائي الفوتون صورة أكثر وضوحا مقارنة بالمجهر الفلوري واسع المجال. يمكن أيضا تطبيق نفس البروتوكول على الأنسجة العضلية من الفئران اليافعة وأجنة الفئران وأنسجة العضلات البالغة المصابة.

كل من أنسجة العضلات اليافعة والجنينية خلايا ساتلية أكثر نشاطا أو سلائف عضلية Pax7 ذات نوى أكبر نسبيا. وبالتالي يصبح من الأسهل تصور الخلايا الساتلية للفئران الأصغر سنا مقارنة بالفئران البالغة. في الأنسجة العضلية المصابة ، تظهر خلايا إيجابية Pax7 أكثر نشاطا.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون خمس ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أنه لا يمكن القضاء تماما على الضوضاء القادمة من التألق الذاتي والربط المناعي غير المحدد بالفأر على الفأر ، ولكن باستخدام هذا البروتوكول يمكن تقليل الضوضاء إلى حد كبير. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعرف على الخلايا الساتلية في التشريح بالتبريد العضلي.