محددة و "دقيقة كشف" spp. "الحمضيات تخضير الممرض" ليبيريباكتير Candidatus استخدام PCR التقليدية على "عينات الأنسجة أوراق الحمضيات"

الهدف العام من هذا الإجراء هو الكشف بدقة عن مسببات الأمراض الخضراء للحمضيات Candidatus liberibacter spp. في أنسجة أوراق الحمضيات. تسمح هذه الطريقة لمزارعي الحمضيات والباحثين بتحديد وجود العامل الممرض المسؤول عن التسبب في تخضير الحمضيات بسرعة ودقة.

سيكون إيان بالمر ، طالب دراسات عليا من مختبري ، الإجراء الموضح. هذه الطريقة فعالة وفعالة من حيث التكلفة وقابلة للتكيف مع التحليل الكمي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراؤه بأقل مستوى من الخبرة والمعدات المختبرية.

استخدم أولا مقصا نظيفا لقطع ورقة طازجة كاملة من شجرة الحمضيات ، وضعها في كيس شطيرة بلاستيكي نظيف. ثم قم بتبريد الهاون والمدقة بإضافة كمية صغيرة من النيتروجين السائل. بعد ذلك ، استخدم المقص لقطع قطع صغيرة من أنسجة الأوراق ، بحجم بوصة مربعة تقريبا.

ضع قطع الأوراق في الهاون لتجميدها على الفور. ابدأ بسرعة في طحن أنسجة الأوراق بالهاون ، حتى يتبخر النيتروجين السائل ، ويبقى مسحوق أخضر ناعم. بعد ذلك ، قم بتبريد ملعقة معدنية في النيتروجين السائل لمدة 10 إلى 15 ثانية.

ثم استخدم الملعقة الباردة لاستخراج الأنسجة الأرضية من الملاط في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. استخدم ماصة سعة 1000 مل لإضافة 600 مل من محلول تحلل النوى إلى العينة. ثم قم بتدوير العينة لمدة ثانية إلى ثلاث ثوان.

احتضان الأنبوب عند 65 درجة مئوية ، في حمام مائي لمدة 15 دقيقة. بمجرد انتهاء فترة الحضانة ، استخدم ماصة 10 مل لإضافة 3 مل من محلول الحمض النووي الريبي إلى اللقيات لإزالة الحمض النووي الريبي. ثم امزج محتويات الأنبوب عن طريق قلبه مرتين إلى خمس مرات.

احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في حاضنة خزانة. بعد 15 دقيقة أضف 200 مل من محلول ترسيب البروتين إلى العينة. دوامة الأنبوب بسرعة عالية لمدة 20 ثانية.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 13000 جرام لمدة ثلاث دقائق. أثناء عملية الطرد المركزي ، أضف 600 مل من الأيزوبروبانول المحفوظ في درجة حرارة الغرفة ، إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل. بعد انتهاء الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية من أنبوب الطرد المركزي إلى الأنبوب الذي يحتوي على الأيزوبروبانول.

تخلص من الحبيبات. اقلب الأنبوب حتى يكون الحمض النووي مرئيا مثل خيط مثل الخيط. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 13000 جم لمدة دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

صب المادة الطافية بعد الطرد المركزي. ثم أضف 600 مل من 70٪ إيثانول إلى الحبيبات. اقلب الأنبوب عدة مرات لغسل الحبيبات.

الطرد المركزي الأنبوب عند 13000 جرام لمدة دقيقة واحدة. بعد انتهاء الطرد المركزي ، قم بشفط المادة الطافية بعناية. ثم اقلب الأنبوب مع فتح الغطاء على ورق ماص ليجف في الهواء لمدة 15 دقيقة.

بمجرد أن تجف ، أضف 100 مل من محلول إعادة ترطيب الحمض النووي إلى الحبيبات. احتضان معلق الحمض النووي عند 65 درجة مئوية في حمام مائي لمدة ساعة. اضغط على الأنبوب بشكل دوري أثناء الخلط.

أضف 1 مل من الماء النقي في كوفيت صغير. اقرأ الماء على أنه فارغ على مقياس الطيف الضوئي. ثم أضف 1 مل من العينة في الكوفيت الصغير.

ضع الكوفيت الصغير على مقياس الطيف الضوئي ، واحصل على تركيز الحمض النووي. قم بتكوين تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق إضافة جميع الكواشف و 100 نانوجرام من الحمض النووي الجيني في أنبوب PCR سعة 50 مل. امزج الكواشف عن طريق تحريك الأنبوب برفق ، متبوعا بجهاز طرد مركزي سريع.

ضع أنبوب PCR في جهاز التدوير الحراري وقم بتشغيل البرنامج. لتحضير جل الاغاروز ، تزن 0.4 جرام من مسحوق الاغاروز. ثم أضف مسحوق الاغاروز إلى قارورة Erlenmeyer سعة 200 مل ، واضبط الحجم على 50 مل مع 1X TAE buffer.

ضعي خليط الاغاروز في الميكروويف على نار عالية لمدة 1.5 دقيقة. يهتز كل 30 ثانية حتى يذوب الاغاروز تماما. بعد ذلك ، أضف 2.5 مل من 10 ملليغرام لكل مليلتر من بروميد الإيثيديوم إلى الاغاروز السائل.

ثم رج القارورة لخلط بروميد الإيثيديوم ، واسكب جل الاغاروز السائل بسرعة في قالب هلام مستو. أدخل على الفور مشطا قياسيا من 12 سنا جليا. اترك الجل يبرد لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ثم قم بإزالة مشط الجل.

الآن ضع الجل المتصلب في وحدة الرحلان الكهربائي المملوءة بمحلول 1X TAE. قم بتحميل إجمالي عينة الحمض النووي المضخمة و 5 مل من الحمض النووي لاحقا في آبار منفصلة على الجل. ابدأ وحدة الرحلان الكهربائي ، عند 90 فولت ثابتة لمدة 35 دقيقة.

ثم قم بإزالة الجل من وحدة الرحلان الكهربائي. بعد ذلك ، ضع الجل على مصباح الأشعة فوق البنفسجية. التقط صورا لأنماط النطاقات الهلامية في transilluminator عند 302 نانومتر.

لتحديد البكتيريا الخضراء ، يتم التحليل الكهربائي للحمض النووي الجيني المضخم PCR الذي تم الحصول عليه من كل من العينات المصابة وغير المصابة. في الجل ، تشير هذه النطاقات المقابلة ل 500 زوج أساسي إلى وجود منطقة معينة من الحمض النووي الريبوسومي Las16S في بكتيريا CL asiaticas. تشير هذه النطاقات المقابلة ل 700 زوج أساسي إلى وجود LAA2 / LAJ5 ، وإدراجها موجودة في تسلسل الحمض النووي لمشغل بيتا الريبوسومي 16S في البكتيريا.

تشير هذه النطاقات المميزة في 400 زوج أساسي إلى تضخيم جين الحمضيات F-box فقط ، والذي يشير إلى التحكم في التضخيم الداخلي. لاعتبار نتائجنا صحيحة ، يلزم وجود هذا النطاق. على العكس من ذلك ، فإن وجود نطاق فقط في 400 زوج أساسي ، لكن عدم وجود نطاقات أخرى عند 500 و 700 زوج أساسي يشير إلى وجود نسيج حمضيات صحي.

بمجرد إتقان هذه التقنية ، يمكن القيام بها في حوالي أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. يمكن تكييف هذا الإجراء للسماح بأداء المزيد من الطرق الكمية ، مثل RTQPCR للكشف عن كمية العامل الممرض الموجودة.