مقايسة المستندة إلى الخلوي تدفق التعرف على المركبات التي تعطل ملزمة للامتحانات المسمى فلوريسسينتلي تشيموكيني يجند 12 لمستقبلات تشيموكيني الامتحانات 4
مارس 10, 2018
تدفق ويرد التحليل القائم على الخلوي الخلوي ملزم يستخدم أساسا كأداة لفحص لتحديد المركبات التي تحول دون ربط يجند chemokine للامتحانات المسمى فلوريسسينتلي 12 (CXCL12) لمستقبلات تشيموكيني الامتحانات 4 (CXCR4).
العام من الفحص القائم على الخلية هو تحديد الجزيئات التي ترتبط بمستقبلات مقترنة ببروتين G. بناء على قدرتها على التنافس مع الترابط المسمى بالفلورسنت للارتباط بالمستقبل. يمكن أن يدعم اختبار ربط المنافسة اكتشاف دواء مستقبلات بروتين G.
كما سنوضح مع هذا البروتوكول لمستقبلات الكيموكين ، CXC4. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أن الخلايا الحية تستخدم لتحليل الارتباط الاستقبالي بدلا من مستحضرات الذاكرة. وأن يتم تجنب استخدام مجسات ملصقات النشاط الإشعاعي.
على الرغم من أن هذه الطريقة قد تم إعدادها في البداية لدراسة الارتباط بمستقبلات الكيموكينات CXCR4 ، إلا أنه يمكن أيضا تطويرها ل GPCR الأخرى التي توجد لها روابط تحمل علامة الفلورسنت. للبدء ، قم بتوزيع 100 ميكرولتر من المحلول المركب في صفيحة سفلية شفافة 96 مستديرة جيدا ، وفقا لتخطيط تجريبي محدد مسبقا. أضف 50 ميكرولترا من تعليق الخلية من خزان الكاشف إلى لوحة البئر 96 باستخدام ماصة متعددة القنوات.
احتضن الطبق لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بعد الحضانة ، أضف 50 ميكرولترا من 100 نانوجرام لكل مليلتر CXCL12 المليتر من خزان كاشف مماثل إلى آبار لوحة البئر 96. احتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للوحة البئر 96 عند 400 ضعف الجاذبية لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المادة الطافية من الخلايا المحببة عن طريق التقليب فوق اللوحة. جفف الطبق على منديل ورقي.
أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت SA الطازج من خزان الكاشف إلى الآبار باستخدام ماصة متعددة القنوات. انتقل على الفور إلى الطرد المركزي للوحة مرة أخرى ، لمدة خمس دقائق عند 400 ضعف الجاذبية في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المادة الطافية مرة أخرى عن طريق قلب الطبق ثم تجفيفه على منديل ورقي.
أخيرا ، قم بإعادة تعليق حبيبات الخلية برفق في 200 ميكرولتر من 1٪ بارافورمالدهيد المذاب في PBS. ستعمل هذه الخطوة على إصلاح الخلايا. لتحليل العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي ، ابدأ تشغيل الجهاز وافتح البرنامج المقابل.
حدد المعلمات الخلوية المراد تصورها بتنسيق كتلة نقطية، كمنطقة مبعثر أمامية، ومنطقة تشتت جانبية، وفي عرض الرسم البياني، قناة الكشف عن الفلورو الأربعة. اختر عينة واحدة. على سبيل المثال ، عينة تحكم سلبية ، لأداء بوابات لمجموعة خلايا متجانسة محددة بناء على معلمات التشتت الأمامي والمبعثر الجانبي.
قم بتكييف إعدادات تحميل الخلايا في جهاز قياس التدفق الخلوي. اختر ثلاثة خلطات قبل الحقن. حدد الحقن التلقائي ل 100 ميكرولتر من الخلايا الثابتة ، واستخدم معدل تدفق عينة يبلغ 1.5 ميكرولتر في الثانية.
قم بتشغيل النموذج عن طريق تحديد الحصول على البيانات. ستظهر الآن معلمات التشتت الأمامي والمبعثر الجانبي لهذه العينة ، بالإضافة إلى اكتشاف الفلورو أربعة على الشاشة. الآن ، حدد أداة بوابة البرنامج.
استنادا إلى تصور مخطط النقاط المبعثرة الأمامية والمبعثر الجانبي ، حدد مسبقا مجموعة خلايا متجانسة وقابلة للحياة عن طريق البوابات. حدد لتحليل 20,000 حدث لكل عينة. هذا يعني أنه لكل عينة ، سيتم تحليل 20،000 خلية تقع ضمن بوابات محددة مسبقا ، في النهاية.
سيستمر الحصول على البيانات حتى يتم الوصول إلى هذا العدد من الأحداث. ابدأ الجري عن طريق تحديد الآبار المراد تحليلها أولا. ثم يختار تشغيل الآبار.
سيقوم جهاز قياس التدفق الخلوي الآن بتحليل هذه العينات واحدة تلو الأخرى ، عن طريق تسجيل متوسط شدة التألق لكل عينة. وهو ما يتوافق مع متوسط إشارة الفلورسنت من 20،000 خلية تقع ضمن البوابة المحددة مسبقا. أخيرا ، قم بإجراء تحليل البيانات كما هو موضح في البروتوكول.
بعد الحضانة المسبقة لخلايا الجوكات بتركيزات عالية من AMD3100 ، مضاد CXCR4 غير الثابت والمحدد يتم تقليل متوسط شدة التألق التي تعكس ارتباط CXCL12 المسمى بالكامل تقريبا إلى مستويات الخلفية. يوضح هذا الارتباط المحدد للغاية ل CXCL12 ب CXCR4 المعبر عنه في خلايا jurkat.
المركبات غير القادرة على التنافس مع CXCL12 المسمى للارتباط بمستقبل CXCR4 ، مثل مضاد CCR5 Maraviroc ، لن تؤثر على متوسط شدة التألق. في المقابل ، ستفعل المركبات النشطة للغاية ذلك بطريقة تعتمد على الجرعة. بعد مشاهدة الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء اختبار ربط استقبالي للمنافسة باستخدام الخلايا الحية وقياس التدفق الخلوي.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تصف هذه المقالة مقايسة ارتباط خلوي تعتمد على قياس التدفق الخلوي تهدف إلى تحديد المركبات التي تثبط ارتباط CXCL12 بـ CXCR4. وتستخدم هذه الطريقة خلايا حية لتحليل ارتباط المستقبلات، مما يتجنب استخدام العلامات المشعة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- مقايسات الارتباط الخلوي
- المستقبلات المقترنة ببروتين G
- اكتشاف الأدوية
خلفية علمية
- يعد CXCL12 كيموكين يرتبط بمستقبل CXCR4، وهو مستقبل مقترن بالبروتين G.
- يمكن أن يساعد تحديد مثبطات هذا الارتباط في تطوير الأدوية.
- غالبًا ما تتضمن الطرق التقليدية استخدام المواد المشعة، وهو الأمر الذي يسعى هذا المقايسة لتجنبه.
- يوفر استخدام الخلايا الحية تمثيلًا أكثر دقة للتفاعلات البيولوجية.
الغرض من الدراسة
- تطوير أداة فحص لتحديد المركبات التي تثبط ارتباط CXCL12 بمستقبل CXCR4.
- إثبات مزايا استخدام الخلايا الحية في مقايسات الارتباط.
- دعم جهود اكتشاف الأدوية التي تستهدف المستقبلات المقترنة ببروتين G.
الطرق المستخدمة
- قياس التدفق الخلوي لتحليل الارتباط الخلوي.
- استخدام ربيطات موسومة فلورياً لتقييم تنافس الارتباط.
- مقايسات الخلايا الحية لتقييم تفاعلات المستقبلات.
- تجنب الوسم الإشعاعي في الإعداد التجريبي.
النتائج الرئيسية
- ينجح المقايسة في تحديد المركبات التي تثبط ارتباط CXCL12.
- يوفر تحليل الخلايا الحية بيانات أكثر صلة مقارنة بالطرق التقليدية.
- تعد هذه الطريقة فعالة لفحص المرشحين المحتملين من الأدوية.
- تدعم النتائج جدوى استخدام هذه المقايسة في اكتشاف الأدوية.
الاستنتاجات
- يعد المقايسة القائمة على قياس التدفق الخلوي أداة قيمة لتحديد مثبطات CXCR4.
- يعزز استخدام الخلايا الحية من دقة دراسات الارتباط.
- يؤدي تجنب استخدام المواد المشعة إلى تبسيط العملية التجريبية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح مقايسة الارتباط التنافسي القائمة على قياس التدفق الخلوي لفرق الصيدلة الحيوية تحديد الجزيئات الصغيرة التي تعطل تفاعلات CXCL12-CXCR4، وهو هدف رئيسي في خطوط تطوير علاجات الأورام والأمراض الالتهابية. ومن خلال استخدام خلايا حية ورابطات فلورية، تتجنب هذه الطريقة استخدام المواد المشعة مع توفير بيانات ارتباط ذات صلة فسيولوجياً. كما تدعم هذه الطريقة التحقق من صحة الهدف في المراحل المبكرة وتحديد المركبات الرائدة من خلال تقديم قراءات كمية وقابلة للتكرار لترتيب أولويات المركبات.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من صحة الهدف
- القيمة العلمية: يتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال قياس التأثيرات المباشرة للمركبات على ارتباط المستقبل بالرابط في سياق خلوي أصلي.
- القيمة التشغيلية: يوفر قراءة وظيفية تقلل من المخاطر المتعلقة باستهداف CXCR4 من خلال التأكيد الميكانيكي لنشاط المركب.
- القيمة التنبؤية: يدعم فرز المحفظة الدوائية من خلال تحديد المركبات التي تظهر ملامح تثبيط تعتمد على الجرعة، مما يشير إلى الارتباط بالهدف.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: توليد بيانات كمية حول تثبيط الارتباط من خلال متوسط شدة الفلورة، مما يتيح تحليل العلاقة بين البنية والنشاط.
- القيمة التشغيلية: قابل للتكييف مع تنسيق الأطباق ذات الـ 96 بئراً، مما يزيد من إنتاجية حملات الفحص مع الحفاظ على اتساق المقايسة.
- قابلية إعادة الاستخدام: يؤسس لمنصة موحدة قابلة للتطبيق على مستقبلات GPCRs أخرى عند توفر ربيطات فلورية، مما يقلل من جهود إعادة التطوير.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يستخدم خلايا Jurkat حية لتعكس تعبير المستقبلات وديناميكيات الارتباط الفسيولوجية، مما يعزز الصلة الترجمية.
- القيمة التشغيلية: ينتج بيانات متوافقة مع التقييمات قبل السريرية اللاحقة من خلال تأكيد تأثيرات المركبات الموجهة نحو هدف محدد.
- تخفيف المخاطر: يقلل من النتائج الإيجابية الكاذبة عن طريق التمييز بين مثبطات CXCR4 النوعية والمركبات غير النوعية (على سبيل المثال، لا يظهر Maraviroc أي تأثير).
تكامل مسار العمل والتدفق الإجرائي
يتناسب هذا المقايسة ضمن سلسلة الاكتشاف المستمرة، بدءاً من التحقق من الهدف وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة، مما يوفر بيانات الارتباط التي توجه عملية التطوير من المركبات المكتشفة إلى المركبات الرائدة. كما أنها تكمل الفرز المظهري من خلال إضافة عمق ميكانيكي إلى توصيف المركبات.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات من خلال قياس التعطيل الناجم عن المركبات لارتباط CXCL12 بـ CXCR4 في الخلايا الحية.
- الفحص: يتيح جاهزية المقايسة من خلال خطوات موحدة للحضن والغسيل والتثبيت المتوافقة مع نتائج قياس التدفق الخلوي.
- التحليلات: يوفر متوسط كثافة الفلورية كمخرج كمي لمقارنة قوة المركبات وفعاليتها عبر جرعات مختلفة.
- الأبحاث الانتقالية: يستخدم خطاً خلوياً ذا صلة بالمرض (Jurkat) يعبر عن CXCR4، مما يربط بيانات الارتباط بالتأثير العلاجي المحتمل في السرطان والالتهابات.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يعمل كمنصة ارتباط نموذجية قابلة للنقل عبر أهداف GPCR، مما يزيد من العائد على الاستثمار في تطوير المقايسات.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في ارتباط الهدف من خلال إثبات الارتباط النوعي والقابل للإزاحة لـ CXCL12 بـ CXCR4.
- القيمة التشغيلية: تضمن إمكانية التكرار من خلال توحيد معايير التعامل مع الخلايا، وأوقات التحضين، وبروتوكولات تحديد البوابات في قياس التدفق الخلوي.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف (go/no-go) من خلال تصفية المركبات التي تفتقر إلى النشاط النوعي للهدف في مرحلة مبكرة من عملية الاكتشاف.
- التأثير على المحفظة: تتيح التقدم المعدل حسب المخاطر من خلال تحديد المركبات التي تمتلك ملامح تثبيط واضحة تعتمد على الجرعة.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تشغيل قياس التدفق الخلوي، والتعويض، واستراتيجيات تحديد البوابات (gating) لمجموعات الخلايا الحيوية.
- يعتمد على توفر أجهزة قياس التدفق الخلوي القادرة على اكتشاف الإشارات الفلورية في القناة المناسبة (مثل FITC أو ما يعادلها).
- يستلزم توحيد معايير تحضير الخلايا، وتخفيف المركبات، وظروف الحضن عبر دفعات الفحص.
- يتطلب التكيف مع مستقبلات GPCRs أخرى تطوير أو شراء ربيطات (ligands) موسومة فلورياً ومحددة للمستقبل المستهدف.
- تشمل القيود العملية مدة المقايسة (~90 دقيقة بالإضافة إلى وقت التحليل) والحاجة إلى تحسين تركيز الربيطة لضمان نسب قوية للإشارة إلى الضجيج.
