تكييف 3 ' التضخيم السريع من كدنا ينتهي إلى خريطة المحاضر في السرطان

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد تسلسل نصوص الرنا المرسال من النهاية ثلاثية الأبعاد إلى المناطق داخل منطقة ترميز البروتين باستخدام بادئات متداخلة خاصة بالنسخ في اثنين من تفاعلات البوليميراز المتسلسل اللاحقة وتسلسل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل المنقى. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في المجال الجيني ، مثل تحديد إشارة polyadenylation ، وكودون التوقف ، وتسلسل المنطقة ثلاثية الأعداد الأولية غير المترجمة من النص. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تطبيقها على أي نسخة إذا كان تسلسل المنطقة الصغيرة من إطار القراءة المفتوح هو أن الآثار المترتبة على هذه التقنية تمتد نحو تشخيص السرطان ، لأنها يمكن أن تكتشف جينات الاندماج الخاصة بالورم ومتغيرات اللصق.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما حددنا نصوص جديدة بمناطق غير مترجمة ثلاثية الحروف غير مميزة سابقا. لبدء البروتوكول ، قم بإذابة خليط خلايا الفينول والجوانيدين إيزوثيوسيانات على الجليد. بمجرد إذابته ، أضف 100 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق في غطاء PCR.

دوامة العينة لمدة 10 إلى 15 ثانية حتى يصبح الخليط ورديا وغير شفاف. بعد ذلك ، احتضن العينة على الجليد لمدة 15 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للعينة لمدة 15 دقيقة عند 20 ، 800 جم وأربع درجات مئوية.

قم بإزالة المرحلة المائية العلوية عديمة اللون بعناية ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر. ثم انتقل إلى هطول الأمطار وأضف كمية متساوية من الأيزوبروبانول إلى العينة. أضف ميكرولتر واحد من المرسب المشترك إلى العينة ليكون بمثابة ناقل للحمض النووي الريبي وللمساعدة في تصور الحمض النووي الريبي في الخطوات اللاحقة.

احتضان العينات عند 80 درجة مئوية لمدة أربع ساعات على الأقل. بعد الحضانة ، انقل العينة إلى جهاز طرد مركزي مبرد وتدور لمدة 35 دقيقة عند 20 ، 800 جم وأربع درجات مئوية. بعد الدوران ، سيظهر الحمض النووي الريبي كمواصفات زرقاء في الجزء السفلي من الأنبوب.

قم بإزالة الأيزوبروبانول بعناية من العينة. أضف 500 ميكرولتر من 80٪ من الإيثانول وأعد تعليق الحبيبات عن طريق الدوامة لفترة وجيزة لمدة ثلاث ثوان. الطرد المركزي العينة مرة أخرى.

قم بإزالة كل الإيثانول من العينة واترك العينة تجف في الهواء لمدة 10 دقائق تقريبا. بمجرد أن تجف العينة ، أعد تعليقها في 35 ميكرولترا من الماء الخالي من RNase. ثم ضع العينة على كتلة حرارية.

اضبط على 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق للتأكد من أن الحمض النووي الريبي في المحلول بالكامل. بعد التسخين ، ضع الأنبوب على الفور على الجليد. للحصول على حجم تفاعل نهائي يبلغ 50 ميكرولتر ، أضف أربعة ميكروغرامات من إجمالي الحمض النووي الريبي مع الماء المضاف إلى الحجم الإجمالي البالغ 22 ميكرولتر إلى أنبوب جديد.

أضف ميكرولترين من برايمر Oligo dT 25 من محلول التمهيدي 10 ميكرومولار. من مجموعة النسخ العكسي ، أضف ميكرولترين من مثبط RNase ، وثمانية ميكرولترات من المخزن المؤقت للتفاعل 5x ، وأربعة ميكرولترات من 10 ملليمولات dNTPs ، وميكرولترين من النسخ العكسي. قم بإعداد تفاعل بدون نسخ عكسي ليكون بمثابة عنصر تحكم سلبي.

احتضان الأنبوب عند 42 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة ، انقل الأنبوب مباشرة إلى الثلج قبل نقله إلى كتلة التسخين. ثم سخني الأنبوب على حرارة 75 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

بعد تسخينه 75 درجة مئوية ، ضع الأنبوب على الثلج. انقل لترين ميكرولترين من (كدنا) إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل الجديد سعة 0.5 مل. أضف ميكرولتر واحد من التمهيدي الأمامي وميكرولتر واحد من التمهيدي العكسي من محلول برايمر 10 ملليمول.

اصنع ما يصل إلى 12.5 ميكرولتر عن طريق إضافة 8.5 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز وإضافة 12.5 ميكرولتر من 2x PCR إلى مزيج الهلام الرئيسي. ثم أدخل شروط الدورة الحرارية PCR المدرجة على الشاشة وقم بتشغيل PCR. بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بإعداد جل أغروز 1٪ ملطخ ببروميد الإيثيديوم.

قم بإذابة جرام واحد من الاغاروز في 100 مل من ثلاثي الأسيتات أو عازلة TAE في قارورة سعة 250 مل. اغلي المحتويات في الميكروويف. اترك الجل يبرد لمدة دقيقة واحدة ، وأضف 7.5 ميكرولتر من محلول بروميد الإيثيديوم في غطاء الدخان.

تخلط جيدا عن طريق تحريك القارورة. صب المحتويات في جهاز هلام أفقي واترك الجل يتجمد في درجة حرارة الغرفة في غطاء الدخان لمدة 30 دقيقة على الأقل. قم بتغطية الجل بمخزن مؤقت 1x TAE وقم بتحميل 10 ميكرولترات من منتج PCR على هلام الاغاروز مع ثلاثة إلى خمسة ميكرولترات من سلم الوزن الجزيئي للحمض النووي.

قم بتشغيل الجل على حرارة 175 فولت لمدة 10 دقائق. بالنسبة لأول تفاعل البوليميراز المتسلسل ، انقل ميكرولتر واحد من (كدنا) إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وأضف خمسة ميكرولترات من المخزن المؤقت لتفاعل 10x Pfu. أضف ميكرولتر واحد من أول برايمر أمامي متداخل ، وميكرولتر واحد من T7 Oligo dT 25 التمهيدي ، وميكرولتر واحد من dNTPs من محلول 10 ملليمول.

اصنع ما يصل إلى 49 ميكرولترا من الحجم الإجمالي بإضافة 40 ميكرولتر من الماء. أضف ميكرولتر واحد من بوليميراز الحمض النووي Pfu واخلط جيدا. ثم قم بتشغيل PCR.

بعد ذلك ، قم بإعداد PCR الثاني. انقل ميكرولترين من المنتجات من أول تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل الجديد واخلطه مع خمسة ميكرولترات من 10x Pfu ultra two التفاعل المؤقت. أضف ميكرولتر واحد من برايمر PCR المتداخل الثاني ، وميكرولتر واحد من برايمر T7 وميكرولتر واحد من dNTPs.

اصنع ما يصل إلى 49 ميكرولترا من إجمالي حجم التفاعل عن طريق إضافة 39 ميكرولترا من الماء وأضف ميكرولتر واحد من بوليميراز Pfu DNA. قم بتشغيل PCR باستخدام نفس ملف تعريف PCR مثل إعداد PCR الأول. بدلا من ذلك ، بدلا من استخدام بوليميراز Pfu DNA ، يمكن استخدام بوليميراز الحمض النووي الخيمري في اثنين من تفاعلات البوليميراز المتسلسل المختلفة.

خذ خمسة إلى عشرة ميكرولترات من منتج PCR الثاني وقم بتشغيله على هلام الاغاروز. أخيرا ، تصور النتيجة على جهاز تصوير. يظهر جل الاغاروز هذا منتجين متميزين من تفاعل البوليميراز المتسلسل يستخدمان نفس البرايمر الأمامي ولكن بادئات عكسية مختلفة ومنتج PCR مميز يحتوي على برايمر أمامي وعكسي مميز.

البادئات المثالية لاستخدامها في التفاعل القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل هي تلك التي تعطي منتجا واحدا مميزا لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). أنتجت المنتجات من تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الثاني مع بوليميراز الحمض النووي Pfu وبوليميراز الحمض النووي الخيمري منتجات PCR بنفس الحجم على الرغم من وجود ظروف مختلفة لدورة تفاعل البوليميراز المتسلسل لسباق ثلاثي الرئيسي. أظهرت الضوابط السلبية للنسخ العكسي عدم وجود تلوث جيني للحمض النووي الريبي المستخدم في تخليق (كدنا) وكذلك في التفاعلات النهائية اللاحقة.

تم إرسال منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل المنقى بالهلام للتسلسل. حدد تسلسل Sanger التمثيلي من مخطط كروماتوغرام تسلسل موقع كودون التوقف وإشارة polyadenylation المفترضة والموقع بالإضافة إلى ذيل بولي A في منتج RACE ثلاثي الرئيسي. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر ارتداء معدات واقية وقفازات في جميع الأوقات.

بالإضافة إلى ذلك ، استخدم DNase و RNase المعقمين لأنابيب الكواشف والمستهلكات الأخرى. لا تنس أن العمل مع الفينول والكلوروفورم يمكن أن يكون خطيرا للغاية. ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل استخدام الكواشف في غطاء المحرك والتخلص من المواد في حاوية نفايات مخصصة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.