تشكيل بيوفيلم التي يسببها الملح الصفراوية في مسببات الأمراض المعوية: تقنيات لتحديد وتقدير حجم

الهدف العام من بروتوكول تكوين وتقييم الأغشية الحيوية هذا هو تحديد قدرة مسببات الأمراض البكتيرية المعوية على تكوين غشاء حيوي ، خاصة في الظروف التي تحاكي العبور المعدي المعوي والتعرض للأملاح الصفراوية. يمكن أن تساعد الطرق في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التسبب في المرض البكتيري ، مثل قدرة مسببات الأمراض المعوية على البقاء على قيد الحياة في ظروف الملح الصفراوي القاسية في الجهاز الهضمي. الميزة الرئيسية للتقنيات هي أن النتائج المجمعة من المقايسات الثلاثة تدعم التوصيف المتعمق لتكوين الأغشية الحيوية استجابة للتعرض للملح الصفراوي لكل مسببات الأمراض.

خطرت لنا في البداية فكرة الطرق المدمجة ، نظرا للحاجة إلى تحديد تكوين الأغشية الحيوية الناجم عن ملح الصفراء بشكل كامل في الشيغيلا فليكسنير. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن جوانب الفحص يمكن أن تحد من قابلية التكاثر. لذا يرجى الانتباه إلى الخطوات الحاسمة لضمان قابلية التكرار.

سيظهر الإجراءات أعضاء من مختبري ، كورتني نيكرسون ، زميل ما بعد الدكتوراه ، وأليخاندرو يانوس ، زميل أبحاث سريرية. أولا ، قم بتسمية أنبوبين سعة 1.5 مليلتر باسم TSB و TSB بالإضافة إلى BS. ثم أضف ملليلتر واحد من TSB أو TSB بالإضافة إلى BS إلى الأنابيب المعنية. بعد ذلك ، قم بتلقيح الأنابيب ب 20 ميكرولترا من الثقافة الليلية عند تخفيف من واحد إلى 50.

ثم أضف 130 ميكرولترا من وسائط التحكم غير الملقحة إلى كل من الآبار الثلاثة في صفيحة معقمة وشفافة ومسطحة القاع ومعالجة بزراعة الأنسجة و96 بئرا. سيكون هذا هو عنصر التحكم الفارغ. أضف 130 ميكرولترا من الثقافة الملقحة في كل من الآبار الثلاثة.

بعد إضافة التحكم والثقافة الملقحة في الآبار المعنية ، احتضان الصفيحة المكونة من 96 بئرا لمدة أربع إلى 24 ساعة عند 37 درجة مئوية ، بشكل ثابت. بمجرد انتهاء الحضانة ، اضبط عنصر التحكم جيدا على قارئ اللوحة. بعد ذلك ، استنشق وسط الثقافة من كل بئر.

ثم اغسل الآبار برفق مرة واحدة باستخدام 200 ميكرولتر من PBS المعقمة. بعد الغسيل ، قم بسحب PBS ، ثم اقلب اللوحة حتى تجف لمدة 20 دقيقة تقريبا. من المهم جدا ضمان الإزالة اللطيفة للوسائط والغسيل اللطيف ، لضمان عدم إزعاج مصفوفة EPS.

بعد ذلك ، أضف 150 ميكرولترا من البنفسج البلوري بنسبة 0.5٪ إلى كل من الآبار التجريبية والتحكم. ثم احتضن الطبق لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد خمس دقائق ، اغسل الآبار مرة واحدة ب 400 ميكرولتر من الماء المقطر.

أضف 200 ميكرولتر من الماء المقطر لغسل الآبار خمس مرات. بعد كل الغسلات الخمس ، اقلب اللوحة واتركها تجف تماما ، محمية من الضوء. من أجل الحصول على نتائج متسقة ، من المهم تجفيف العينات جيدا قبل المتابعة.

بعد تجفيف اللوحة تماما ، استخدم 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 95٪ لإزالة بقع الآبار. ثم اترك الطبق على الخلاط لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، لتجنب التبخر. بعد 30 دقيقة ، سجل OD 540 على قارئ اللوحة.

للكشف شبه الكمي عن EPS، استخدم ماصة متعددة القنوات لنقل وسط الاستزراع إلى صفيحة شفافة سعة 96 بئرا. ثم استخدم 200 ميكرولتر من كاشف التثبيت لإصلاح اللوح الأسود لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. الآن سجل قراءة OD 600 عن طريق تعيين عنصر التحكم جيدا وكذلك الفراغ للتوحيد القياسي.

ثم سجل قراءة وسيط الثقافة أثناء تثبيت السكان الملتزمين. بمجرد اكتمال التثبيت ، قم بإزالة الكاشف وتخلص منه في النفايات الخطرة. ثم استخدم 200 ميكرولتر من PBS المعقم لغسل الآبار برفق مرتين.

بعد الغسيل ، استنشق PBS. بعد ذلك ، أضف 150 ميكرولتر من 25 ميكروغراما لكل مليلتر من ConA-FITC. احتضن الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.

بعد الحضانة ، اغسل الآبار برفق ب 200 ميكرولتر من PBS. ثم أضف 150 ميكرولترا من PBS إلى كل بئر ، وسجل التألق عند 488 نانومتر. بعد تحضير الكواشف الطازجة ، قم بتسخين PBS و PBS بالجلوكوز و PBS مع الأملاح الصفراوية و PBS مع الجلوكوز والأملاح الصفراوية إلى 27 درجة مئوية.

ثم قم بتسجيل قيم OD 600 من لوحة الأغشية الحيوية الليلية على قارئ اللوحة عن طريق ضبط عنصر التحكم جيدا على أنه فارغ. بعد ذلك ، قم بشفط وسط الثقافة باستخدام خط فراغ ، دون إزعاج السكان الملتصقين على السطح البلاستيكي. اغسل الآبار برفق مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من PBS المعقم.

بعد الغسيل باستخدام PBS ، أضف 130 ميكرولترا من PBS الدافئ مسبقا ، و PBS مع الجلوكوز ، و PBS مع الأملاح الصفراوية ، و PBS مع الأملاح الصفراوية والجلوكوز إلى كل من الآبار الثلاثة ، ثم احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة ، أخرج الطبق من الحاضنة. ماصة المادة الطافية إلى طبق معقم جديد مكون من 96 بئرا.

أخيرا ، قم بإعداد واحد إلى 10 تخفيفات تسلسلية للطافي مع PBS في اللوحة المكونة من 96 بئرا ، أو في كتلة التخفيف. ثم استخدم ماصة متعددة القنوات لنقل خمسة ميكرولترات من كل تخفيف على ألواح أجار LB. احتضان الصفائح عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

في اليوم التالي ، احسب عدد المستعمرات. يتم الحصول على قطعة الشريط لتحديد تكوين الأغشية الحيوية المعتمدة على ملح الصفراء في مسببات الأمراض المعوية. يتم ذلك عن طريق رسم قيم OD 540 للسلالات الفردية في وجود وعدم وجود أملاح صفراوية في الوسط.

تظهر المؤامرة زيادة كبيرة في تكوين الأغشية الحيوية لمعظم سلالات مسببات الأمراض ، باستثناء Enteroaggrative E.Coli. بعد ذلك ، يتم الكشف عن EPS الناتج أثناء تكوين الأغشية الحيوية عن طريق تحديد كمية ConA-FITC التي تحتفظ بها EPS. تظهر مخطط الشريط زيادة كبيرة في قراءة التألق في وجود أملاح الصفراو.

هذا يؤكد إنتاج EPS لمسببات الأمراض Shigella flexneri. هنا ، يكون التلوين المعتمد على ConA-FITC لمصفوفة EPS مرتفعا بشكل ملحوظ عند التعرض للأملاح الصفراوية. يشير هذا إلى تكوين الأغشية الحيوية البكتيرية ، التي تتميز بمصفوفة EPS الغنية بالسكريات.

يتم استخدام One X PBS و DAPI لإظهار الخصوصية المعتمدة على FITC ووجود الحمض النووي البكتيري ، على التوالي. أخيرا ، يتم حساب عدد الوحدات المكونة للمستعمرة لتحليل تشتت البكتيريا المعتمدة على الملح الصفراوي من الأغشية الحيوية. تظهر المؤامرة أن البكتيريا تتشتت بسهولة من الأغشية الحيوية في PBS و PBS مع الجلوكوز.

ومع ذلك ، فإن تعرض البكتيريا للأملاح الصفراوية يمنع بشكل كبير تشتتها من الأغشية الحيوية. تم تطوير هذه المقايسات لالتقاط وتحديد الأغشية الحيوية الخبيثة العابرة التي تشكلها مسببات الأمراض المعوية ، وخاصة الشيغيلا فليكسنيري ، استجابة للتعرض للملح الصفراوي في الأمعاء الدقيقة قبل الإصابة في القولون. قد تحتاج التعديلات على المقايسات ، مثل أنواع الوسائط الأساسية ، وتكوين الأملاح الصفراوية المستخدمة ، وظروف نمو البكتيريا ، إلى التعديل لمسببات الأمراض المختلفة ، اعتمادا على موقع العدوى داخل الجهاز الهضمي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء كل من المقايسات لتقييم تكوين الأغشية الحيوية بدقة في السلالة البكتيرية أو الطافرة التي تهمك. تذكر أن العمل مع مسببات الأمراض وبعض الحلول يمكن أن يكون خطيرا للغاية. يجب دائما مراعاة الاحتياطات مثل طرق المناولة والتخلص المناسبة عند إجراء هذه الفحوصات.

علاوة على ذلك ، يعد تحضير وسائط الملح الصفراوي الطازج ، والضوابط المناسبة ، وضمان التكاثر التجريبي أمرا حيويا لتحليل البيانات وتأكيد النمط الظاهري للغشاء الحيوي الناجم عن الملح الصفروي. وستمكن هذه التقنيات، وهي تطبيقات فريدة ومبتكرة عالية الإنتاجية للطرق التقليدية، من القياس الكمي المناسب للعملية المتعددة الأوجه والدينامية لتكوين الأغشية الحيوية الناجمة عن الملح الصفراوي في مسببات الأمراض المعوية.