بروتوكول مبليكس لمتعدد omic تحاليل عينات التربة

تستخدم هذه الطريقة في مجالات البروتينات والتمثيل الغذائي والدهون من خلال المساعدة في الحصول على معلومات شاملة حول التغيرات الجزيئية التي تحدث في المجتمعات الميكروبية المرتبطة بالتربة بسبب الاضطرابات البيئية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الحصول على تحليلات متعددة من عينة واحدة من التربة يزيد من الدقة والدقة مع تقليل وقت تحضير العينة وجهدا. للبدء ، لكل عينة تربة 20 جراما ، تزن 10 جرامات في أنبوبين منفصلين من الميثانول / الكلوروفورم سعة 50 مل.

استخدم أنابيب بلاستيكية مصنوعة من PTFE ، حيث أن الكلوروفورم سوف يتسرب معظم المواد البلاستيكية ، مما يؤدي إلى تلويث العينات. أضف ما يقرب من 10 مل من الفولاذ المقاوم للصدأ المغسول بالكلوروفورم وخرز العقيق إلى كل أنبوب. بعد ذلك ، أثناء وجودك على الجليد ، أضف أربعة ملليلتر من الماء البارد فائق النقاء إلى كل أنبوب ، وانقل العينات في دلو ثلج إلى غطاء دخان.

باستخدام ماصة مصلية زجاجية سعة 25 مليلتر ، أضف بسرعة 20 مل من الكلوروفورم المثلج إلى حجم / حجم الميثانول إلى الأنابيب. شد الأغطية ودوامة خليط التربة في المحلول. يساعد الكلوروفورم والميثانول على تكسير جدار الخلية لبدائيات النوى كما يعطل الأنشطة الأنزيمية.

بعد ذلك ، قم بتوصيل الأنابيب بمرفقات دوامة أنبوبية سعة 50 مليلتر ، وقم بدوامة أفقية لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية داخل الثلاجة إن أمكن. بعد ذلك ، ضع العينات داخل فريزر سالب 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة تقريبا لتبريدها تماما. بعد ذلك ، باستخدام مسبار صوتي داخل غطاء الدخان ، قم بصوتنة كل عينة بمسبار بسعة ستة ملليمترات و 1/4 بوصة بسعة 60٪ لمدة 30 ثانية على الجليد.

بعد الصوتنة ، ضع العينات في ثلابة 80 درجة مئوية الفريزر ، حيث يمكن أن يولد صوتنة الكثير من الحرارة. بعد تكرار خطوات الدوامة الأفقية والصوتنة والتجميد ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 4 ، 000 مرة من الجاذبية وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. في هذه المرحلة ، سيتم فصل العينة إلى طبقة المستقلب العليا ، والطبقة البينية للبروتين ، والطبقة الدهنية السفلية.

ضع العينات على الثلج. بعد ذلك ، داخل غطاء الدخان ، استخدم ماصة مصلية زجاجية سعة 10 ملليلتر لنقل طبقات المستقلب العلوية من أنبوبين سعة 50 مليلتر إلى قارورة زجاجية واحدة كبيرة. الآن ، قم بإمالة الأنبوب سعة 50 مليلتر قليلا لتحرير الطبقة البينية للبروتين بحيث تطفو بحرية على الطبقة الدهنية السفلية.

بعد ذلك ، باستخدام ملعقة مختبر نظيفة من الفولاذ المقاوم للصدأ ، اغرف بعناية كلتا الطبقتين البينية للبروتين ، وضعها معا في أنبوب واحد جديد سعة 50 مل. باستخدام ماصة زجاجية مصلية سعة 25 ملليلترا، انقل طبقات الدهون السفلية إلى قارورة زجاجية واحدة كبيرة. أضف 20 مل من الميثانول المثلج إلى الأنبوبين اللذين يحتويهما الحطام وإلى الأنبوب الواحد مع الطبقة البينية للبروتين.

دوامة الأنابيب لفترة وجيزة, والطرد المركزي حبيبات الحطام والطبقة البينية البروتين عند 4, 000 مرة الجاذبية وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. ثم صب الميثانول في حاوية نفايات خطرة داخل غطاء الدخان. قم بتجميد كريات البروتين والحطام في النيتروجين السائل ، وجففها في مجمل الدهون لمدة ساعتين تقريبا.

أضف 20 مل من المخزن المؤقت لإذابة البروتين في 50 ملليمولار ثلاثية المخزن المؤقت ، ودرجة الحموضة 8.0 ، إلى كل من كريات الحطام و 10 ملليلتر إلى أنبوب الطبقة البينية للبروتين. في غطاء الدخان ، يقوم المسبار بصوتنة العينات بسعة 20٪ لمدة 30 ثانية لإدخالها في المحلول. دوامة العينات لمدة دقيقتين.

بعد ذلك ، ضع عينة الطبقة البينية للبروتين في دوار أنبوب المختبر عند 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لإذابة البروتين. قم بتدوير عينات الحطام أفقيا لمدة 10 دقائق إضافية لتحلل أي خلايا سليمة متبقية. ثم قم بالتدوير مع عينات الطبقة البينية للبروتين لمدة 20 دقيقة المتبقية.

قم بالطرد المركزي لجميع العينات عند 4 ، 500 مرة من الجاذبية في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ، وجمع المادة الطافية من كل أنبوب لكل عينة إلى أنبوبين سعة 50 ملليلترا. أضف 10 مل من محلول الذوبان إلى حبيبات الطبقة البينية للبروتين. ثم, صوتنة ودوامة الحبيبات مرة أخرى في المحلول.

بعد الطرد المركزي ، قم بدمج المواد الطافية بالتساوي في أنبوبين سعة 50 مليلتر مع المواد الطافية لحبيبات الحطام ، وقم بعمل الطرد المركزي للأنابيب في دوار دلو بزاوية ثابتة عند 8 ، 000 مرة من الجاذبية وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق من أجل تكوير أي حطام متبقي. قسم المواد الطافية إلى أنبوبين سعة 50 مل. بعد ذلك ، باستخدام ماصة مصلية زجاجية سعة 10 مل ، أضف 7.5 مل من TCA إلى كل أنبوب.

دوامة العينات في المحلول. ثم ضع العينات في فريزر سالب 20 درجة مئوية لمدة ساعتين إلى ليلة كاملة. لتكويب البروتين المترسب ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 4 ، 500 ضعف الجاذبية وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق ، وصب المادة الطافية في النفايات.

أضف 10 مل من الأسيتون المثلج بنسبة 100٪ إلى كل حبيبات بروتين. دوامة الأنابيب ، واجمعها مثل الكريات في أنبوب واحد. جهاز طرد مركزي ثم صب الأسيتون.

باستخدام حجم أصغر من الأسيتون ، اغسل الحبيبات مرتين ، وانقل التعليق إلى أنبوب سعة 1.5 أو ملليلتر للدوران النهائي. صب المادة الطافية في النفايات ، واترك الحبيبات تجف مقلوبة على ورقة في غطاء الدخان لمدة 20 دقيقة تقريبا. اعتمادا على حجم الحبيبات ، أضف 100 إلى 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإذابة البروتين.

صوتية ودوامة الحبيبات في محلول. لاحظ أن العينة قد تكون لزجة بسبب ترسيب المواد الدبالية مع البروتين ، والتي ستتم إزالتها مع الطرد المركزي اللاحق. أخيرا ، رج العينة في حاضنة أو شاكر عند 300 دورة في الدقيقة و 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، لإذابة البروتين في محلول قبل الشروع في هضم البروتين أو التجميد المفاجئ للمعالجة المستقبلية.

باستخدام بروتوكول MPLEx الموضح في هذا الفيديو ، تم استخراج 3،376 ببتيدا و 105 دهون و 102 مستقلبات قطبية من تربة البراري الأصلية في كانساس ، وتتم مقارنة استخراج البروتينات في البروتوكول بمجموعات استخراج البروتين واستخراج SDS باستخدام المرحلة العكسية LC-MS / MS. عند مقارنة ثلاث نسخ مكررة من مجموعة استخراج البروتين التجارية وطرق SDS ، تداخلت 12٪ فقط من الببتيدات بين التقنيتين ، مما يدل على تعقيد المجتمع الميكروبي وتأثيرات الاستخراج المختلفة. عند مقارنة MPLEx مع مجموعة استخراج البروتين التجارية ومستخلصات SDS ، تم أيضا اكتشاف حوالي 38٪ من الببتيدات التي لوحظت باستخدام طريقة MPLEx عند استخدام SDS و / أو استخراج المجموعة التجارية.

بالنظر إلى عدد الأنواع في المجتمع البكتيري للتربة في كانساس والميتاجينوما الخاص بها ، فإن تداخل تعريفات الببتيد معقول. كما هو موضح هنا ، تم تقييم قابلية التطبيق الواسع لنهج MPLEx سابقا باستخدام العتائق S.acidocaldarius ، وهو اتحاد أحادي البكتيريا ، وأنسجة قشرة دماغ الفأر ، والبول البشري ، وأوراق A.thaliana. في جميع الحالات ، كان عدد البروتينات التي لوحظت من طريقة MPLEx مشابها لعدد البروتينات الخاصة بعناصر التحكم ، مما يشير إلى فائدته للعديد من أنواع العينات المختلفة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الحصول على البروتينات والمستقلبات والدهون من عينة واحدة من التربة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تكون مرنا ، حيث تختلف جميع أنواع التربة. على سبيل المثال ، سيختلف حجم الطبقة البينية للبروتين ، اعتمادا على الكتلة الحيوية للتربة والمواد الدبالية الموجودة في التربة.

لا تنس أن العمل مع الكلوروفورم يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل العمل في غطاء الدخان أثناء محاولة هذا الإجراء.