استخدام "المحطة الطرفية ترانسفيراز" بوساطة dUTP نك نهاية الوسم (TUNEL) و Caspase 3/7 فحوصات "تدبير موت الخلايا البشرة" في الضفادع مع تشيتريديوميكوسيس

الهدف العام من هذه التجربة هو مراقبة تأثير العامل الممرض الفطري البرمائي batrachochytrium dendrobatidis على موت الخلايا المبرمج وموت الخلايا في أنسجة البشرة للضفادع. يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في فهم أمراض الحياة البرية مثل ما إذا كانت العدوى تسبب موت الخلايا أو ، على العكس من ذلك ، إذا كانت هناك آليات مناعية ضد العدوى. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن إجراؤها على عينات خزعة الأنسجة الصغيرة بحيث يمكن أخذ عينات من الأفراد الصغار بشكل متكرر طوال فترة العدوى.

لبدء هذا الإجراء ، قم بإعداد شرائح زجاجية محبة للماء مع عينة من الأنسجة كما هو موضح في بروتوكول النص. لإزالة البارافينات من أقسام الأنسجة ، اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام الزيلين لمدة خمس دقائق في وعاء كوبلين. بعد ذلك ، اغسل الشرائح بالإيثانول بنسبة 100٪ مرتين لمدة خمس دقائق لكل منهما.

بعد ذلك ، اغسل الشرائح بنسبة 95٪ من الإيثانول و 70٪ الإيثانول لمدة ثلاث دقائق لكل منهما. ثم اغسل الشرائح مرة واحدة باستخدام PBS لمدة خمس دقائق. لإعداد شرائح التحكم التجريبية والسلبية، قم بمعالجة الأنسجة مسبقا عن طريق إضافة البروتيناز K المخفف حديثا مباشرة إلى الشرائح.

احتضن الشرائح لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل الشرائح في PBS مرتين لمدة دقيقتين لكل منهما. لتحضير شرائح التحكم الإيجابية ، قم بمعالجة الأنسجة مسبقا باستخدام مخزن DN المؤقت ثم احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك ، قم بإذابة DNase واحد في مخزن DN المؤقت إلى تركيز نهائي قدره 0.1 ميكروغرام لكل ملليلتر. أضف محلول DNase المحضر إلى الشرائح. احتضن الشرائح لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

ثم اغسل الشرائح بالماء المقطر في وعاء كوبلين خمس مرات لمدة ثلاث دقائق لكل منها. قم بإخماد التفاعل في 3٪ بيروكسيد الهيدروجين في PBS لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، اغسل الشرائح في PBS مرتين لمدة دقيقتين لكل منهما.

ثم أضف عازلة التوازن إلى الأنسجة الموجودة على الشرائح. احتضن لمدة 10 ثوان في درجة حرارة الغرفة. ثم اضغط على السائل الزائد حول قسم الأنسجة.

تمييع إنزيم ديوكسي نوكليوتيديل ترانسفيراز الطرفي في المخزن المؤقت للتفاعل. ثم قم بإضافته إلى الأنسجة الموجودة على شرائح التحكم التجريبية والإيجابية. احتضان في غرفة رطبة لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية.

بعد ذلك ، ضع الشرائح في جرة كوبلين تحتوي على تركيز العمل للمخزن المؤقت للتوقف. حرك لمدة 15 ثانية ثم احتضن الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، اغسل الشرائح باستخدام PBS ثلاث مرات لمدة دقيقة واحدة لكل منها واضغط على السائل الزائد.

بعد ذلك ، أضف المقترن المضاد للديجوكسيجينين ، المسخن مسبقا إلى درجة حرارة الغرفة ، مباشرة على الأنسجة. احتضان الشرائح لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة مظلمة رطبة. بعد اكتمال الحضانة ، اغسل الشرائح باستخدام PBS أربع مرات لمدة دقيقتين لكل منهما.

اضغط على أي سائل زائد. ثم أضف وسيط التثبيت إلى الشرائح. أضف 15 ميكرولترا من محلول DAPI إلى وسط التركيب على الشرائح.

قم بتغطية كل شريحة بزلة غطاء وختم بطلاء الأظافر. اترك الشرائح تجف في الظلام. باستخدام مجهر الفلورسنت ، راقب الشرائح فور الانتهاء من عملية الوقوف.

التقط صورا بمقدار 400 مرة على فترات عشوائية على طول كل قسم من أقسام الجلد. عد الخلايا الزرقاء الملطخة ب DAPI للتأكد من ظهور ما لا يقل عن 100 خلية لكل قسم من الجلد لكل. بعد ذلك ، احسب عدد الخلايا الموجبة ل TUNEL التي تظهر كخلايا مفردة حمراء ذات حواف خلية واضحة.

للبدء ، استخدم مجهر ضوئي مقلوب 40 مرة لالتقاط صورة لكل من أصابع الضفدع. ارسم خطوطا حول حافة مشبك إصبع القدم واستخدم برنامج التصوير لتقدير المنطقة داخل الشكل. لتقييم مساحة سطح عينة الجلد ثلاثية الأبعاد، اضرب المساحة المقدرة في pi.

لاستخراج البروتينات من عينة إصبع الضفدع المجمدة، ضع العينة في أنبوب طرد مركزي دقيق بغطاء لولبي سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على 100 ميكرولتر من عينة عازلة وخرزتين من الفولاذ المقاوم للصدأ. استخدم مضرب حبة بأقصى سرعة لتحلل الخلايا. بعد ذلك ، ضع الأنبوب على الجليد لمدة ثلاث دقائق.

ثم ، قم بالطرد المركزي للأنبوب لجمع المادة الطافية. لإجراء اختبار الكاسباز 3/7 في صفيحة 384 بئرا ، أضف 10 ميكرولترات من عينة المخزن المؤقت كفارغ و 10 ميكرولتر من مستخلص البروتين في ثلاث نسخ. بعد ذلك ، قم بتحويل 10 ميكرولتر من كاشف الكاسباز 3/7 المتاح تجاريا إلى مستخلص البروتين والآبار الفارغة.

ثم رج الطبق برفق لمدة 15 ثانية لخلط الكواشف. احتضن في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 30 دقيقة. أخيرا ، استخدم قارئ لوحة مضيئة لقياس تلألؤ العينة.

في هذه الدراسة ، تصور المصابة خلايا إيجابية ل TUNEL بشكل ملحوظ مقارنة بالحيوانات الضابطة كما هو موضح في الخلايا الملونة باللون الأحمر أو الوردي. في الضابطة ، يوجد عدد قليل من الخلايا الإيجابية ل TUNEL ، ولا تتركز في البشرة. في المصابة ، تكون الخلايا الإيجابية ل TUNEL أكثر تواترا في البشرة.

تكون الخلايا الإيجابية ل TUNEL أكثر تركيزا في مشاهد الخلايا المصابة والمجاورة لها مباشرة. أيضا ، هناك خلايا إيجابية TUNEL أكثر انتشارا فوق البشرة وفي طبقات البشرة التي تكون أعمق من مكان وجود العامل الممرض الفطري. في المصابة ، هناك المزيد من الخلايا الإيجابية ل TUNEL في جميع أنواع الجلد الثلاثة بمستوى عال بشكل خاص في جلد الفخذ والفينتر.

في مقايسة الكاسباز ، ترتبط شدة العدوى ارتباطا إيجابيا بنشاط كاسباز 3/7. بالإضافة إلى ذلك ، اختلف نشاط الكاسباز 3/7 في المصابة وغير المصابة بمرور الوقت. انخفض نشاط Caspase 3/7 خلال الأسابيع القليلة الأولى بعد التلقيح ثم زاد في نهاية الأسبوع السابع في المصابة.

ظل نشاط Caspase 3/7 ثابتا في الأفراد غير المصابين. أثناء محاولة إجراء اختبار TUNEL ، من المهم قراءة الشرائح في نفس يوم الاختبار لتجنب فقدان الحساسية والحفاظ على الشرائح في مكان بارد ومظلم لحماية الأصباغ. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اكتشاف موت الخلايا المبرمج وموت الخلايا باستخدام طريقتين مختلفتين للكشف في عينات الأنسجة الصغيرة مثل جلد البرمائيات.