ميكروديسيكشن شرائح الأنسجة الكلوية الأولية، وإدماج مع تكنولوجيا بناء رواية خالية من السقالة

الهدف العام من إجراء التشريح المجهري هذا هو عزل أجزاء منفصلة من الأنسجة الكلوية الحية ذات البنية الكلوية السليمة لتطبيقات هندسة الأنسجة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال هندسة الأنسجة مثل هل يمكن حصاد أجزاء كاملة من أنسجة الأعضاء الأولية المعزولة بشكل معقم وإبقائها حية في الثقافة؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الأجزاء تحتوي على بنية كلوية سليمة بدلا من استخدام خطوط الخلايا لإعادة إنشاء عضو معقد مع أكثر من 26 نوعا مختلفا من الخلايا.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج مرض الكلى في المرحلة النهائية لأن هذه التركيبات ستحسن الترشيح وقد تساعد المرضى على الابتعاد عن غسيل الكلى. أثناء الجراحة ، ارتد معدات جراحية مناسبة بما في ذلك قناع وقبعة لتقليل مخاطر التلوث. وبالمثل ، ابذل قصارى جهدك للحفاظ على العقم طوال الوقت.

ابدأ الاستعدادات عن طريق لف طاولة العمليات. بعد ذلك ، افتح حزمة الأدوات المعقمة على الستائر المعقمة. يجب أن تشتمل على ثلاثة مرقئ صغير ، ملقط ناعم بأسنان ، ملقط ناعم بدون أسنان ، ومقص قزحية مستقيم.

قم بتغطية منتصف طاولة العمليات بستارة جراحية ثانية غير مثقبة. قبل إعداد غرفة العمليات ، قم بإعداد 50 مل من DBPS المكمل بالمضادات الحيوية وخمسة ملليلتر في أنبوب سعة 15 مل. الآن قم بتخدير فأر C57 الأسود البالغ من العمر ثمانية إلى 12 أسبوعا وراقب مستوى التخدير بشكل دوري من خلال تقييم منعكس الدواسة بقرصة إصبع القدم الثابتة.

بعد ذلك ، استخدمي كريم إزالة الشعر لإزالة كل الشعر من منطقة الجذع البطني وشطف الكريم والشعر بالماء المقطر. ثم انقل الماوس إلى طاولة العمليات وضعه تحت الستارة غير المثبتة. الآن قم بقص فتحة مربعة بطول سنتيمترين مربعة في الستارة فوق بطن الفأر.

ثم افرك الجلد المكشوف ببوفيدون اليود متبوعا بنسبة 70٪ إيثانول ثلاث مرات لتعقيم الجلد واستكمال الاستعدادات للجراحة. ابدأ الجراحة باستخدام ملقط رفيع مع الأسنان ومقص القزحية. قم بعمل شق جلدي من ثلاثة إلى أربعة سنتيمترات موازية لخط الوسط نصف سنتيمتر على يسار خط الوسط.

بعد ذلك ، أمسك الصفاق باستخدام ملقط ناعم بدون أسنان وشق بمقص القزحية لدخول تجويف البطن. ثم ضع مرقئ الدم على الحواف الجانبية العلوية والسفلية للجلد والصفاق لوضع التوتر بشكل جانبي وتعزيز التعرض. الآن قم بتحويل محتويات الأمعاء بدقة إلى يمين البطن لكشف الكلية اليسرى.

ثم ضع الجر برفق على الكلى لرفعها من البطن. الآن ضع مقص الهموس عبر نقير الكلى واستخدم مقص القزحية لتمرير الحالب والأوعية الكلوية. ثم انقل الكلية إلى أنبوب 1٪ من البكتيريا العقدية DBPS على الجليد.

خذ هذا الأنبوب إلى غطاء مزرعة معقم للمعالجة. هناك ، انقل الكلى إلى طبق بتري 60 ملم واشطفها مرتين بخمسة ملليلتر من DPBS الطازج الذي يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم. بعد الغسيل الثاني ، الكلى في خمسة ملليلتر من DBPS في طبق جديد 60 ملم.

ثم قم بإعداد طبق بتري إضافي يحتوي على خمسة ملليلتر فقط من DBPS لاستخدامه لاحقا. استمر في استخدام تقنية معقمة بما في ذلك القفازات المعقمة والقناع الجراحي والمنتفخ لتقليل مخاطر التلوث. ثم ثنى منطقة المسرح والمنطقة المحيطة بالمجهر الاستريو.

بعد ذلك ، ضع صفائح لاصقة بلاستيكية على مقابض التركيز المجهر ورشها بنسبة 70٪ من الإيثانول. ثم قم بتشغيل الإضاءة المزدوجة ذات الرأس المنحنية لإضاءة المسرح. الآن على الستائر المعقمة ، افتح عبوة من الأدوات المعقمة التي تحتوي على ملقط ناعم بدون أسنان ، ومقبض مشرط ، وشفرة مشرط رقم 15 ، واثنين من مرقئ الدم المستقيم ، وإبرتين مجوفتين بقياس 30.5.

ضع الشفرة رقم 15 على مقبض المشرط وقم بتوصيل شفرة واحدة بكل محور محول إبرة لإنشاء أدوات تشريح الإبرة. الآن انقل الطبقين ، أحدهما مع الكلى في DPBS والآخر DPBS فقط ، إلى منطقة المجهر. قم بإزالة غطاء طبق الكلى وتركيز المجهر على السطح الأمامي أو الخلفي للكلية بتكبير 3.2 إلى 4 مرات.

بعد ذلك ، باستخدام اليد غير المهيمنة ، استخدم ملقطا دقيقا بدون أسنان لثقب الكلية وتثبيتها على الطبق في القطبين السفليين والعلويين من الكلى. ثم باستخدام اليد المهيمنة ، استخدم الشفرة رقم 15 لإزالة طبقة المحفظة الليفية الشفافة من السطح المكشوف. حلق 0.5 ملم سطحي من السطح المكشوف لسطح الكلى لإزالة ما تبقى من الكبسولة.

استمر باستخدام الشفرة رقم 15 لتشريح هرم مقلوب من الأنسجة من المنطقة غير المكسوة التي تبلغ مساحتها حوالي ملليمترين مربعين. ثم انقل الأنسجة إلى طبق نظيف من DBPS وتخلص من ما تبقى من الكلى. ركز الآن على الأنسجة التي تم تشريحها وقلل التكبير إلى 1.5 إلى 2.0X.

باستخدام أداتي إبرة الإرقاء كأدوات قطع ، قم بتقطيع جزء الأنسجة إلى قطع أصغر تدريجيا حتى تصبح أجزاء الأنسجة بحجم أطراف الإبرة أو أصغر. يجب إنتاج حوالي 50 قطعة. هذا جزء مهم من الإجراء.

يحتاج كل جزء إلى تقريب قطر طرف إبرة القياس 30-1 / 2 عن كثب لتجنب الأجزاء الكبيرة التي يمكن أن تعيق الانتشار. أعد الأنسجة إلى غطاء مزرعة الأنسجة وقم بإزالة DPBS باستخدام ماصة دقيقة P1000. ثم أضف مرة أخرى خمسة ملليمترات من DMEM مكملا بمصل بقري للجنين بنسبة 10٪ و 1٪ بكتيريا القلم.

ثم قم بزراعة الأنسجة أو زرعها داخل التركيبات الخلوية على الفور. تم فحص صلاحية الأجزاء الكلوية السليمة الناتجة عن الإجراء الموصوف على مدى ثلاثة أيام في المزرعة باستخدام مقايسة الجدوى. يوجد الكالسيوم الفلوري الأخضر AM مع نشاط إستيراز داخل الخلايا الذي يدل على الخلايا الحية.

يظهر homodimer ethidium الفلورسنت الأحمر -1 مع فقدان سلامة غشاء البلازما. عندما تم تضمين الأجزاء الكلوية في تركيبات الخلايا الليفية البطانية الخالية من السقالات ، بحلول اليوم الثالث تم دمجها مع التركيبات الخلوية لتشكيل هياكل سليمة. حافظت التركيبات على شبكتها البطانية قبل الأوعية الدموية الموضحة من خلال وضع العلامات باستخدام عامل فون ويلبراند.

يمكن رؤية الخلايا الظهارية الكلوية باللون الأخضر المسمى بواسطة cytokertain-18. لاختبار وظائف الكلى في المختبر ، تم احتضان التركيبات باستخدام الألبومين المسمى FITC. بينما تم العثور على الألبومين المتبقي بعيدا عن أجزاء الأنسجة الكلوية المضمنة ، كانت هناك أيضا نقاط ساخنة في الخلايا الظهارية الأنبوبية الكلوية.

هذه النقاط الساخنة هي الألبومين الذي يعبر داخل اللمعة والذي يعتقد أنه يمثل امتصاص الألبومين في البنية الخلوية للجزء الكلوي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الأجزاء الكلوية من كلى الفئران لتطبيقات هندسة الأنسجة. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذا الإجراء في غضون ساعة إلى 1-1 / 2 ساعة.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى بما في ذلك بذر التركيبات الخلوية من أجل الإجابة على أسئلة أخرى تتعلق بتصنيع بنية الكلى وتوصيفها. لا تنس أن العمل باستخدام الأدوات الجراحية واسطوانات الأكسجين المضغوطة يمكن أن يكون خطيرا للغاية. كن حذرا عند العمل بأشياء حادة وتذكر تثبيت خزانات الأكسجين على مقعد المختبر.